Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie
Summary
Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.
Abstract
siRNA en shRNA-gemedieerde knock down (KD) methoden van regulering van de expressie van genen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van de gen- en eiwit functie. Echter, in het geval dat de KD van de proteïne van belang een dodelijk effect op cellen is of het verwachte effect van de KD tijdafhankelijke, onvoorwaardelijke KD methoden zijn niet geschikt. Voorwaardelijke systemen zijn meer geschikt in deze gevallen en het onderwerp van veel belang zijn geweest. Deze omvatten Ecdysone-afleidbare overexpressie systemen, Cytochrome P-450 inductie systeem1, en de tetracycline geregeld gen expressiesystemen.
Tetracycline geregeld Enumeration gen expressie omkeerbare controle over eiwit expressie door inductie van shRNA expressie in aanwezigheid van tetracycline. In dit protocol presenteren wij een experimenteel ontwerp met behulp van functionele Tet-ON systeem in menselijke kanker cellijnen voor voorwaardelijke regulering van de genexpressie. Vervolgens tonen wij het gebruik van dit systeem in de studie van tumor cel-monocyt interactie.
Introduction
Tumor verbonden macrofagen (TAMs) bijdragen aan tumor ontwikkeling door bevordering van tumorgroei metastase en regulering van de immuunrespons2. Kanker cellen werven inflammatoire monocyten, die infiltreren tumor en differentiëren in pro-tumorigene TAMs3. Infiltratie van de tumor met TAMs correleert met slechte klinische resultaten en is gekoppeld aan de immunosuppressieve rol van macrofagen4,5. Echter, de mechanismen van de aanwerving van de macrofagen aan de tumor niet goed zijn onderzocht en een beter begrip van de betrokken trajecten is van cruciaal belang voor verdere vooruitgang van het veld en beloftevolle therapieën. Een van de uitdagingen bij het bestuderen van de interacties tussen de tumorcellen en de normale cellen in de tumor communicatie (TME) is de complexiteit van de mechanismen en de cellen die de betrokken zijn, waarbij in vitro benaderingen waarmee dissectie van de overspraak. Hier presenteren we een veelzijdige methodologie die kan worden toegepast om te studeren het paracrine effect van een kanker cel-afgeleide, secreted eiwit op migratie van andere celtypes zoals macrofagen, in vitro. Met behulp van een systeem waar de uitdrukking van de shRNA tegen een kanker cel afkomstige eiwitten die betrokken zijn bij de aanwerving van monocyten is onder de controle van de tetracycline afleidbare promotor, is het effect van de paracrine van de secreted eiwit op monocyten quantitated. In dit protocol, klonen van shRNA sequenties in de tetracycline gereglementeerde vector wordt gepresenteerd gevolgd door generatie van stabiele kanker cellijnen. Verder, de zuivering van primaire menselijke monocyten en een Boyden kamer assay worden gebruikt om te analyseren het effect van de paracrine van een kankercel afkomstig eiwit op migratie van monocyten.
Downregulatie van eiwit codering genen wordt het vaak toegepast met siRNA en shRNA technieken, hoewel niet zonder beperkingen in het gebruik ervan. De lange termijn knock-down (KD) van genen kan secundaire adaptieve reacties van cellen die met de experimentele resultaten interfereren uitlokken. Ontbreken van temporele controle over genexpressie maakt het uitdagend om te bestuderen van de dynamische rol van een proteïne in tijd of in de rol van een eiwit dat van cruciaal belang voor de overleving van de cel. Deze kwestie is vooral belangrijk in in-vivo -instellingen, waar de rol van een proteïne in de ontwikkeling van de tumor en progressie wellicht Downregulatie van de uitdrukking van de proteïne van belang alleen nadat de tumor is ingesteld. Voorwaardelijke KD heeft het voordeel van het voorkomen van een te vroeg dodelijk effect van de KD op cellen en om analyse van de rol van de proteïne in de verschillende stadia van tumorgroei, terwijl onvoorwaardelijke KD kan leiden tot gebrek aan ontwikkeling van de tumor.
Een aantal voorwaardelijke KD systemen zijn ontwikkeld om de beperkingen van stabiele KD. De voorwaardelijke gene expressiesystemen Ecdysone-afleidbare overexpressie systemen, de cytochroom P-450 inductie systeem1, omvatten en tetracycline geregeld gen expressiesystemen. De tetracycline-gereglementeerde gene expressiesystemen toestaan controle over de expressie van de shRNA na toevoeging van de antibiotica tetracycline (of zijn stabieler analoge – doxycycline). In Tet-ON systemen, de uitdrukking van shRNA wordt geïnduceerd in aanwezigheid van tetracycline/doxycycline resulterend in een genexpressie KD, terwijl in de Tet-OFF systemen, de uitdrukking van shRNA wordt onderdrukt in het bijzijn van tetracycline resulterend in genexpressie. Een nadeel van tetracycline-afleidbare systeem is eerder gerapporteerde lage niveaus van meningsuiting shRNA bij gebrek aan doxycycline – zogenaamde leakiness6,7. In de Tet-ON beschreven systeem hier, op de administratie van tetracycline, de binding van constitutively uitgedrukt tetracycline onderdrukker (TetR) eiwit aan de Tet-responsief element (TRE) reeks binnen de H1 promotor regio van de shRNA van belang is onderdrukt. Dit resulteert in expressie van shRNA en remming van de vertaling van de proteïne van belang in een tetracycline-afhankelijke manier8,9.
Andere beschikbare Tet-ON systemen omvatten gelijktijdige knock-in van de reeks tussen TATA vak en proximale reeks element (PSE) en tussen TATA vak en transcriptie pas site ontwikkeld door Chan et al.TetO. 10 dit systeem vereist minder dan toxische doses van tetracycline te reguleren shRNA expressie, echter onder een niet-geïnduceerde staat, lage niveaus van shRNA worden uitgedrukt. De Krüppel-geassocieerde vak (KRAB) gebaseerd Tet-ON systeem11 bevat een KRAB, een zink-vinger-eiwit, dat onderwerpen genen binnen een bereik van 3 kb van de KRAB bindende site transcriptionele onderdrukking gelegen. Het chimeer eiwit tTRKRAB kan binden aan TetO, en als gevolg van het grote aantal DNA regelbare capaciteit, TetO niet nodig te beperken tussen de transcriptie start van de site en de promotor en lage impact hebben op de activiteit van de promotor. Onder de niet-geïnduceerde staat, werd deze beheersbare RNA interferentie systeem gemeld om te laten zien van een lager niveau van gelekte expressie van shRNA11,12; het vereist echter een sequentiële, twee-vector benadering van klonen. In vergelijking met eerder ontwikkelde voorwaardelijke KD systemen zoals het Ecdysone-afleidbare overexpressie systeem of cytochroom P-450 inductie systeem, het tetracycline-gereguleerde systeem heeft het voordeel van de robuustheid en de omkeerbaarheid, en is daarom de meest gebruikte routinematig systeem13. Het systeem gebruikt in dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van de dubbele TetO knock-in systeem en KRAB Tet-ON systeem als het vereist ongecompliceerd, enkele vector kloont, waardoor snelle rendering van meerdere klonen, en het vertoont zeer lage niveaus van leakiness in de het ontbreken van doxycycline.
TME is cruciaal voor de ontwikkeling van kanker. Om de tumorgroei, werven kankercellen inflammatoire monocyten door afscheidende Chemotactische eiwitten. Aangeworven monocyten infiltreren van de tumor en onderscheid maken in pro-tumorigene TAMs die aan de tumorgroei en uitzaaiing bijdragen. In vitro studies van de immuun cel aanwerving gebruiken migratie testen, met Boyden kamer assay wordt wijd gebruikt14,15,16,17. In deze test, is de eiwitbron chemoattractant, bijvoorbeeld, kankercellen, of een gezuiverde eiwit, in de onderste zaal geplaatst. Immuuncellen worden geplaatst in de bovenste kamer gescheiden met poreuze membraan van de onderste compartiment. Cellen migreren naar de toenemende helling van chemoattractant, en die gevonden aan de lagere kant van het membraan zijn gekleurd en geteld onder de Microscoop. Hier testen we de functie van de chemoattractant van het Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1) op monocyten door het genereren van stabiele, afleidbare kanker cellijnen waar uitdrukking van PAI-1 wordt gereguleerd door doxycycline toevoeging. We gebruiken menselijke primaire monocyten in de Boyden assay voor de migratie van de kamer om de rol van PAI-1 in monocyt migratie beoordelen. Verschillen tussen menselijke primaire monocyten en gebruikte monocytic cellijnen als THP1 zijn gemeld en bevatten verschillende cytokine-expressie patronen18; bijvoorbeeld 5-10-voudige toename in de niveaus van TNF-α expressie door THP1 cellen ten opzichte van menselijke monocyten19. THP1 cellen zijn afgeleid van menselijke leukemie monocytic cellen, zijn gemakkelijk te onderhouden en te vermenigvuldigen met een gemiddelde tijd van 19-50 h20te verdubbelen. Integendeel, worden menselijke monocyten gekenmerkt door een korte levensduur in de afwezigheid van groeifactoren. Aangezien monocyten zijn gezuiverd uit bloed van donoren, een behoorlijke hoeveelheid variabiliteit vindt plaats tussen de individuen en afhankelijk van de methode van de zuivering, kan besmetting met andere celtypes optreden. Niettemin, primaire monocyten relevant zijn en het is aanbevolen om te gebruiken of bevestiging van de resultaten verkregen met de cellijnen van de monocytic met behulp van primaire monocyten in biologisch onderzoek19. Hier beschrijven we een protocol voor zuivering van menselijke primaire monocyten uit perifere bloed. Alternatieve methoden van monocyt zuivering omvatten dichtheid verloop en hechting van de protocollen en twee stap procedure met enkele hellingen van densiteitgradiënt-Hypaque, gevolgd door een Percoll verloop21. De zuiverheid van de bevolking van de monocyt verkregen door deze methoden varieert tussen 70-90%. De hier beschreven methode gebruikt een dichtheid verloop gevolgd door een negatieve immuun selectie22 en maakt de zuivering van menselijke monocyten zonder direct contact met de antilichamen, waardoor het vermijden van hun toevallige activering en resulterend in een > 95% pure bevolking van monocyten.
Het hier gepresenteerde protocol wordt gebruikt voor het instellen van een functionele Tet-ON systeem voor genexpressie KD in menselijke kanker cellijnen om te studeren het chemoattractant effect van het kanker-afgeleide secreted eiwit PAI-1 op monocyten. PAI-1 door een scala aan tumoren is overexpressie en haar expressie paradoxaal genoeg correleert met slechte klinische resultaten23,24. De pro-tumorigene rol van PAI-1 is een gevolg van de pro-angiogenic en anti-apoptotic functioneert25,26. PAI-1 heeft aangetoond bij te dragen tot ontsteking door het bevorderen van de aanwerving van macrofagen op de site van ontsteking27. PAI-1 werd getoond ter bevordering van de gladde spieren cellmigration28,29 en deel te nemen aan de Mac-1 afhankelijk macrophage migration30. PAI-1 overexpressie is ook aangetoond dat een aanzienlijke verbetering van de aanwerving van rauwe 264.7 macrofagen in B16F10 melanoom tumoren31. De rol van PAI-1 TAM migratie is echter niet in detail onderzocht. We beschreven protocol gebruiken om het antwoord op de vraag voor of de PAI-1 monocyten tot kankercellen trekt. Deze methode kan dissectie van de Overspraak tussen tumor en TME door het monddood maken van de secreted eiwitten in kankercellen en analyseren van de componenten van de TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samengesteld van allerlei soorten cellen, is de TME cruciaal voor de ontwikkeling van kanker. Om na te gaan van optimale groei-omstandigheden, trekken kankercellen monocyten door afscheiding van Chemotactische factoren. Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van het mechanisme van monocyt werving door tumor cellen in vitro. Voor dit doel, wordt een combinatie van afleidbare gen expressie systeem, zuivering van primaire menselijke monocyten, en als een voorbeeld van een migratie assay, de Boyden kam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen Jacqueline Rosenberg voor proeflezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de ons Department of Health and Human Services/National Institutes of Health met een grant to YA DeClerck (verlenen 5R01 CA 129377) en de Stichting van de Martell TJ. MH Kubala is de ontvanger van een onderzoek carrière ontwikkeling Fellowship award van de Sabaanse Research Institute op het Children’s Hospital Los Angeles.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
