Denne publikasjonen beskriver fabrikasjon av en organ-on-chip enhet med integrerte elektrodene for direkte kvantifisering av transendothelial motstand (TEER). For validering, blod – hjerne barrieren ble mimicked i microfluidic enheten og barriere funksjonen var overvåket. Metodene presentert for elektrode integrering og direkte TEER kvantifisering gjelder generelt.
Organer-på-chips, i vitro modeller som involverer kultur (human) vev inni microfluidic enheter, er raskt voksende og løfte om å gi nyttig forskning verktøy for å studere helse og sykdom. Betegner barriere funksjonen celle lag kultivert inne organ-on-chip enheter, måles ofte transendothelial eller transepithelial motstand (TEER). Dette er elektrodene vanligvis integrert i chip micromachining metoder å gi mer stabil målinger enn oppnås med manuell innsetting av elektroder i viker på brikken. Men disse elektrodene ofte hemme visuell inspeksjon av studerte celle laget eller krever dyre renrom prosesser for fabrikasjon. For å overvinne disse begrensningene, inneholder enheten beskrevet her fire lett integrert elektroder som plasseres og fast utenfor området kultur gjør visuell inspeksjon mulig. Bruker disse fire elektroder motstanden av seks mål baner kan kvantifiseres, som TEER kan bli direkte isolert, uavhengig av motstanden av kultur medium-fylt microchannels. Blod – hjerne barrieren ble kopiert i denne enheten og dens TEER var overvåket for å vise enhet anvendbarhet. Denne brikken, de integrerte elektrodene og TEER besluttsomhet metoden gjelder generelt organer-på-sjetonger, både å etterligne andre organer eller kan legges inn i eksisterende systemer for orgel-on-chip.
Organer-på-chips er raskt fremstår som en ny og lovende klasse av in vitro vev modeller. 1 i disse modellene kultivert celler inne microfluidic enheter som er konstruert slik at de etterligner den fysiologiske microenvironment i disse cellene. 1 , 2 dette resulterer i mer realistisk fysiologiske eller patologisk atferd i disse cellene enn man kan forvente fra konvensjonelle i vitro modeller med enkel design og grunnleggende funksjon. 3 , 5 , 6 i tillegg organer-på-chips gi et bedre kontrollerbar miljø enn i vivo modeller og kan innlemme både friske og syke vev fra menneskelige opprinnelse trofast gjenskape både menneskelige fysiologi og patologi. Nylig oppsummerte fremskritt i utviklingen av blod – hjerne barrierer sjetonger (BBBs-på-chips) viser at feltet er raskt beveger seg fremover. 7
En annen fordel med organer-på-chips er at de aktiverer sanntid og kontinuerlig overvåking av vev kultivert inne i enheten mikroskopi, on-line biokjemiske analyser og integrerte sensorer. 1 , 2 For eksempel måle transendothelial eller transepithelial motstand (TEER) er en kraftig metode for overvåking ikke-invasively utvikling og avbrudd i barriere-forming vev. 8 , 9 , 10 TEER er elektrisk motstand over en mobilnettet barriere og er derfor om barriere integritet og permeabilitet. 10 organer på sjetonger, mobilnettet barrierer er generelt kultivert på en membran som skiller to fluidic kanaler, som representerer den apikale og basolateral deler av at barrier vev. I slike brikker, kan TEER målinger enkelt utføres med elektroder i inn- og utløp av de to kanalene. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men manuell innsetting og gjeninnsetting av elektrodene kan lett føre plassering feil og dermed variasjoner i målt motstanden som f.eks forskjellene i motstand av lengre eller kortere stier gjennom microchannels betydelig er enn cellen barriere motstanden. 16 for å eliminere gjeninnsette feil, enheter med integrerte elektrodene er foreslått. Men de fleste av disse integrerte elektrodene blokkere visning når inspisere vev kultur17,18,19,20,21 , og spesialiserte renrom prosesser for fabrikasjon. 17 , 22
Orgel-on-chip-enhet som er beskrevet i denne publikasjonen, først brukt i en tidligere publikasjon,16 kombinerer stabiliteten av integrerte elektrodene med synlighet på målt celle laget og lett fabrikasjon. Design og fabrikasjon av denne brikken er avbildet i figur 1. Kort sagt, denne enheten består av to polydimethylsiloxane (PDMS) deler med kanal forlagene som er limt sammen Lekkasje-fri med en polykarbonat membran med 0,4 µm porene i mellom. Fire platina wire elektroder satt inn og fast på plass med en photocurable lim også utenfor området kultur. Alle disse fabrikasjon trinnene kan utføres med generelle laboratorieutstyr og uten behov for et renrom miljø. På toppen av dette, seks impedans målinger kan gjøres ved hjelp av disse fire elektroder, og dermed tillater direkte isolering av den målte TEER, uavhengig av motstanden av microchannels frem til tverrsnittet og dermed minimalisere påvirkning av ikke-biologiske variasjoner i systemet som (re) innsetting feil. 16
Viser anvendelse av denne enheten og direkte TEER målingene, blod – hjerne barrieren (BBB) ble replikert i denne brikken. Denne biologiske barrieren består av spesialiserte endotelceller og regulerer transport mellom blod og hjernen til å gi hjernen homeostase. 23 , 24 for å etterligne BBB, topp kanalen microfluidic enheten ble foret med menneskelige hjerne mikrovaskulær endotelceller fra hCMEC/D3 cellen linje (vennlig levert av Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankrike). 25 metoden presentert, men mer generelt gjelder alle orgel-on-chip enheter med to avdelinger, aktivere direkte TEER besluttsomhet bruke enkelt integrert elektroder.
I dette manuskriptet er først fabrikasjon prosessen med enheten organ-on-chip med integrerte elektrodene beskrevet. Neste, seeding prosedyre og kultur av hjernen endotelceller inne i enheten er forklart, samt på prosessoren TEER målinger. I delen resultater representant TEER målinger vises og databehandling er avklart. Til slutt, barriere funksjon av BBB-on-chip, overvåket i 3 dager, presenteres, viser anvendelse av den presenteres apparat og metoder for å overvåke TEER.
I dette manuskriptet ble prosjektering av en organ-on-chip enhet og direkte fastsettelse av transendothelial-motstand (TEER) av en mobilnettet barriere kultivert enheten presentert. Presentert metoden å integrere elektroder uten renrom utstyr og direkte TEER fastsettelse bruker fire elektroder gjelder alle orgel-on-chip enheter med to microfluidic avdelinger. Chip oppsettet og geometri kan tilpasses tilfredsstiller de så for seg eksperimenter, som fire elektrodene er delt i to deler. Fire elektrodene kan med beleilig settes i viker av eksisterende chips, forutsatt at de er fiksert på plass for varigheten av seks målinger. Lekkasje-fri binding metoden kan optimaliseres for forskjellige membraner og kanal geometrier ved å endre PDMS/toluen forholdet. En høyere toluen innhold fører til et tynnere spin-belagt lag mørtel26 og kan være mer egnet for grunnere og smalere kanaler i PDMS deler. En lavere toluen innhold resulterer i en tykkere mørtel lag26 , og kan være bedre egnet til å omslutte tykkere membraner mellom PDMS deler.
Som kan sees i skjematisk impedans spectra i figur 2A og de eksperimentelle spektra i figur 2E og 2F, påvirkes impedans målinger av tolags kapasitans elektrode mellomstore grensesnittet. På grunn av den lille størrelsen på elektrodene inne microchannels, kan dobbelt lag kapasitans dominere over resistiv platået av mobilnettet barrieren i impedans spectra, kompliserer kvantifisering av TEER. Elektrodene kan settes for å overvinne dette, videre inn kultur kanalene før fiksering. Dette øker arealet av elektroden utsatt til kultur medium og med det tolags kapasitans øker også. Dette resulterer i et skifte av kapasitive skråningen til lavere frekvenser, slik at resistiv platået av mobilnettet barrieren kan lettere anerkjent og kvantifisert. Selv om motstanden av målt banen mellom to elektroder blir mindre, vil dette ikke påvirke TEER kvantifiseringen etter presentert metoden.
Mens måle gjennom mobilnettet barriere, er det mulig at ekstra resistiv platået ikke kan gjenkjennes. Dette kan være et resultat av en fluidic forbindelse mellom de to kanalene, for eksempel hvis membranen er dårlig omsluttet av mørtelen, fører til en målt bane rundt mobilnettet barrieren. I tillegg kan det være elektrisk bro utenfor chip hvis elektrodene er forbundet med en dråpe kultur medium. Dette er vanligvis kombinert med en lavere målt impedans kan løses ved å fjerne denne broen av kultur medium. Til slutt, hvis det er ingen resistiv platå og målt impedansen er flere størrelsesordener høyere enn forventet, kan det være en løs tilknytning i det elektriske ledningsnett eller strømkilden.
I fremtiden, kan fysiologiske relevansen av den gjeldende BBB-on-chip økes ved å utsette endotelceller hvis du vil skråstille stress på fysiologiske nivåer, som er rapportert å fremme BBB differensiering og øke barriere tetthet og er vanskelig å oppnå i konvensjonell i vitro modeller. 29 i tillegg den nedre kanalen den presenterte apparatet gir en egnet avlukke for hjerne-avledet celler til co kultivert med endotelet. Dette er også forventet å øke funksjonen barriere også muliggjør studiet av komplekse interaksjoner mellom relevante celletyper under patologiske forhold. 29
I konklusjonen, orgel-on-chip-enhet som er beskrevet i denne publikasjonen kan være fabrikasjon benytter standard laboratorieutstyr og vises å gi direkte TEER mål med fire integrerte elektrodene som ikke hindre visuell inspeksjon av studerte cellen lag. Anvendelsen av denne enheten i feltet organer-på-chips ble demonstrert av mimicking BBB i denne brikken og overvåking av TEER i kultur perioden. En rekke andre (barriere) organer kan bli etterlignet av inkludert andre relevante celletyper i denne brikken. I tillegg kan metode for å måle TEER enkelt brukes i andre to rom-baserte orgel-on-chip enheter ankommer reproduserbare og meningsfull TEER verdier som kan sammenlignes med over enheter og systemer.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig Johan Bomer fabrikasjon av mold og Mathijs Bronkhorst for fruktbart diskusjoner og hjelp med datarepresentasjon.
Denne forskningen ble finansiert av: SRO biomedisinsk Micro Devices av Li Segerink, MIRA Institutt for Biomedical Engineering og tekniske medisin, Universitetet i Twente; SRO organer-på-Chips av ad van der Meer, MIRA Institutt for Biomedical Engineering og tekniske medisin, Universitetet i Twente; og VESCEL, ERC avansert tilskudd til A. van den Berg (grant nr. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |