جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد
Summary
يصف هذه المخطوطة في زويدجي (الزرد إصابة والجهاز الفخ للنمو وتصوير)، وهو جهاز مجزأة تهدف إلى توجيه وكبح جماح اليرقات الزرد. ويسمح التصميم ترانسيكشن الذيل وطويلة الأجل جمع الصور مجهرية الفلورية العالية الاستبانة من التئام الجروح والتجديد.
Abstract
يرقة الزرد كائن حي نموذجا هاما لعلم الأحياء التنموي والتئام الجروح. علاوة على ذلك، اليرقة الزرد نظاما قيماً ليعيش تصوير مجهرية ذات الدقة العالية للظواهر البيولوجية الحيوية في المكان والزمان مع القرار الخلوية. بيد أن الطريقة التقليدية لتغليف [اغروس] لتصوير مباشر يمكن أن تعوق التنمية اليرقات ونمو الأنسجة. ولذلك، يصف هذه المخطوطة في زويدجي (الزرد إصابة والجهاز الفخ للنمو وتصوير)، الذي صمم وملفقة كجهاز مستقلة وظيفيا لتوجيه اليرقات للفحص المجهري عالية الدقة مع السماح زعنفة والذيلية ترانسيكشن داخل الجهاز والتنمية اللاحقة الذيل غير المقيد وإعادة النمو. يسمح هذا الجهاز لإصابة وتصوير طويلة الأجل مع الحفاظ على السلامة. نظراً لأن العفن زويدجي 3D مطبوعة، التفصيل عن هندستها تجعل من تعديلها بسهولة للتطبيقات التصوير الزرد المتنوعة. وعلاوة على ذلك، يوفر زويدجي العديد من المزايا، مثل الوصول إلى اليرقة أثناء التجريب لإصابة أو لتطبيق المواد الكاشفة، توازيها التوجه لليرقات متعددة لتصوير مبسطة، وإعادة استخدام الجهاز.
Introduction
قدرة التجدد الزرد اليرقات دانيو rerio جعلها كائن نموذج مثالي دراسة استجابة الجرح فضلا عن تضميد الجراح وإعادة نمو1،2،،من34. الوصول إلى مجموعة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا والشفافية التشريحية الزرد لمواصلة تعزيز فائدتها للدراسات في فيفو الجرح استجابة الأحداث، فضلا عن عمليات التجدد الأطول أجلاً4. دراسة هذه العمليات البيولوجية استخدام الاستبانة fluorescence الوقت الفاصل بين الفحص المجهري لذلك يطالب جهاز الزرد تصوير مباشر الذي يسمح لحركة الحد الأدنى لليرقة الزرد والاستقرار عالية مع الحفاظ على استمرارية. مفتاح أن يسمح هذا الجهاز لإصابة فعالة حين الشفاء والتجديد تحدث لم يتأثر بالجهاز.
القياسية يعيش التصوير الاستقرار طريقة تضمين اليرقة في [اغروس] أثناء تصوير لايف يحد من النمو والجرح التجديد5 وقد تزيد معدلات الوفاة منذ اليرقات تبدأ في إظهار علامة على نخر الإجهاد وأنسجة القلب بعد أربعة ساعات4. ولذلك، إزالة [اغروس] من المناطق ذات الاهتمام عادة الضرورية للسماح بالنمو الطبيعي والتجديد6، تعريض اليرقات للأضرار المحتملة ك [اغروس] قطع بعيداً. وعلاوة على ذلك، مع تضمين تقنية [اغروس]، المستخدم يجب توجيه اليرقات في وقت قصير قبل أن يقوي [اغروس]5،،من67. سرعة التلاعب اليرقة لا يتطلب مهارة للمستخدم، فإنه أيضا مخاطر الضرر إلى اليرقة. على الرغم من أن قد وصف أساليب لتحقيق استقرار اليرقة لتصوير مباشر للتحايل على هذه العيوب، مثل أجار مخدد الآبار3 أو ديفيتس8، استعمال المحجم سيليكون الشحوم إلى إنشاء دائرة لتصوير مع الأنابيب البلاستيكية أو غيرها المواد6، وانابيب التناوب9، العديد من هذه الأساليب هي العمالة المكثفة، وفوضوي، وغالباً غير القابل ولا تسمح بالتلاعب بالبيئة (المخدرات العلاجات، مما أدى إلى إصابة إلخ.) بعد أن تم تحميل الأسماك.
لذلك، تم تصميم الجهاز زويدجي (الشكل 1) للتغلب على بعض عيوب أجار المتصاعدة للتصوير حية طويلة الأجل من اليرقات الزرد بينما تسمح بالتلاعب بالعينة. زويدجي يتكون من ثلاث دوائر مستقلة شبه مفتوحة (الشكل 1A) للسماح لتحميل، ضبط النفس، مما أدى إلى إصابة والتصوير من 2 إلى 4 أيام بعد الإخصاب الزرد اليرقات. الجهاز ملفقة من “بولي دايمثيل سيلوكسان” (PDMS) وتوضع على كشف غطاء صحن التصوير أسفل الزجاج 60 ملم. تصميم المقدمة هنا المقصود لدراسات الجرح الشفاء، ولكن استخدام تصميم نمطي وتكنولوجيات التصنيع القياسية تجعل تصميم زويدجي قابلة للتعديل وقابلة لمجموعة متنوعة من الإجراءات التجريبية، خاصة بالنسبة للإجراءات التي وتتطلب الحد الأدنى من ضبط النفس مع التلاعب التجريبية وتصوير طويلة الأجل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وغرض الجهاز زويدجي هو التقاط الفاصل الزمني 3D التصوير بتحقيق الاستقرار وتوجيه الأسماك ضمن المسافة العمل الصغيرة من هدف مجهر عالي الدقة. اجتماع هذه مواصفات التصميم، مع أنها أيضا تحسنا على إعداد التقليدية المستندة إلى أجار للتصوير الحي. هناك ثلاث خطوات حاسمة (أدناه) في تصنيع زويدجي، التي، إ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن تقر تمويل المشاريع الأولية من معهد مورجريدجي للأبحاث والمختبر الضوئية و “الأجهزة الحاسوبية”. نعترف أيضا بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة # R01GM102924 (AH وكوي). خ، دائرة الخدمات الطبية المشتركة، وجمهورية صربسكا، آه وكوي تصور وتصميم الدراسة. خ، ودائرة الخدمات الطبية المشتركة أجرى تجارب جميع مع دعم من DL وعملية كيمبرلي وجمهورية صربسكا. خ، شبيبة، وجمهورية صربسكا، آه وكوي أسهم في كتابة المخطوطة.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
