Op lange termijn levende Imaging Device voor verbeterde experimentele manipulatie van zebravis larven
Summary
Dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die is een verzuilde apparaat ontworpen bedwingen zebrafish larven te oriënteren. Het ontwerp staat staart transect en op lange termijn collectie van hoge-resolutie fluorescentie microscopie beelden van wondgenezing en regeneratie.
Abstract
De larve van de zebravis is een belangrijk model-organisme voor zowel ontwikkelingsbiologie en wondgenezing. Verder is de larve van de zebravis een waardevolle systeem voor live hoge resolutie microscopische beeldvorming van dynamische biologische fenomenen in ruimte en tijd met cellulaire resolutie. Echter kan de traditionele methode van agarose inkapseling voor levende imaging belemmeren larvale ontwikkeling en weefsel hergroei. Daarom dit manuscript beschrijft de zWEDGI (zebrafish Wounding en Entrapment apparaat voor groei en Imaging), die werd ontworpen en gefabriceerd als een functioneel verzuilde apparaat om te oriënteren larven voor hoge resolutie microscopie voorzien in de mogelijkheid caudal fin transect binnen het apparaat, de latere ongebreidelde staart ontwikkeling en de uitgroei. Dit apparaat voorziet verwonden en op lange termijn beeldvorming met behoud van de levensvatbaarheid. Gezien het feit dat de zWEDGI schimmel is 3D afgedrukt, de aanpasbaarheid van de geometrieën maken het eenvoudig aangepast voor uiteenlopende zebrafish beeldbewerkingstoepassingen. De zWEDGI biedt bovendien dat talloze voordelen, zoals toegang tot de larve tijdens experimenten voor verwonding of voor de toepassing van de reagentia, parallel oriëntatie van meerdere larven voor gestroomlijnde beeldvorming en herbruikbaarheid van het apparaat.
Introduction
Het regeneratieve vermogen van zebravis larven Danio rerio laten een ideale modelorganisme voor behandeling van de wond reactie evenals genezing en hergroei1,2,3,4. Toegang tot een array van transgene zebrafish lijnen en zebrafish de anatomische transparantie verder verbeteren hun nut voor in vivo studies van wond reactie evenementen evenals langere regeneratieve processen4. Studie van deze biologische processen met behulp van hoge-resolutie time-lapse fluorescentie microscopie daarom vraagt om een levende zebrafish beeldapparaat die voor een hoge stabiliteit en minimale bewegingen van de larve van de zebravis zorgt met behoud van de levensvatbaarheid. Het is de sleutel dat het apparaat zorgt voor effectieve verwonden terwijl genezing en regeneratie plaatsvinden niet beïnvloed door het apparaat.
De levende imaging stabilisatie standaardmethode voor het insluiten van de larve in agarose tijdens live imaging beperkt groei en regeneratie5 wond en sterftecijfers kan verhogen aangezien larven beginnen te tonen teken van cardiale necrose van de stress en weefsel na vier uur4. Daarom, verwijdering van agarose uit regio’s van belang is het vaak nodig om normale ontwikkeling en regeneratie6, bloot de larven tot potentiële schade als de agarose is weggesneden. Bovendien moet de gebruiker met de agarose techniek te embedding, oriënteren van de larven in de korte tijd voordat de agarose5,6,7 stolt. Snel manipuleren van de larve vergt niet alleen de vaardigheid van de gebruiker, het ook risico’s van schade aan de larve. Hoewel methoden te stabiliseren de larve voor levende imaging zijn beschreven om te omzeilen deze nadelen, zoals geribbelde agar wells3 of divets8, het gebruik van siliconen vacuüm vet maken een imaging kamer met PVC-buizen of andere materialen6, roterende buis9, veel van deze methoden zijn arbeid intensieve, rommelig, vaak niet herbruikbaar en niet is toegestaan om milieu te manipuleren (drug behandelingen, verwonding enz.) nadat de vis is gemonteerd.
Daarom werd het zWEDGI apparaat (Figuur 1) ontworpen om overwinnen enkele van de nadelen van agar montage voor lange termijn live beeldvorming van zebravis larven terwijl manipulatie van het monster toelaat. De zWEDGI bestaat uit drie halfopen verzuilde kamers (figuur 1A) toe voor het laden, terughoudendheid, verwonding en beeldvorming van 2 tot 4 dagen na bevruchting zebrafish larven. Het apparaat is vervaardigd uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) en op de slip van de cover van een 60 mm glas onder imaging schotel geplaatst. Het hier gepresenteerde ontwerp was bedoeld voor wond genezing studies, maar het gebruik van een modulair ontwerp en fabricage van standaard technologieën maken het zWEDGI ontwerp halster en vatbaar voor een verscheidenheid van experimentele procedures, met name voor procedures die vereist minimale terughoudendheid met experimentele manipulatie en op lange termijn denkbaar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van het apparaat zWEDGI is 3D time-lapse imaging door te stabiliseren en de vis binnen de kleine afstand van de doelstelling van een hoge-resolutie Microscoop kunt vastleggen. Met inachtneming van deze ontwerp-specificaties, is het ook een verbetering over traditionele agar gebaseerde voorbereiding voor levende imaging. Er zijn drie essentiële stappen (zie hieronder) in de fabricage van de zWEDGI, die, indien niet correct gedaan, in defecte apparaten resulteren kan:
PDMS voorbereidin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen primaire projectfinanciering uit het Morgridge Instituut voor onderzoek en het laboratorium voor optische en computationele instrumentatie. We erkennen ook financiering van NIH # R01GM102924 (AH en KWE). KH, JMS, RS, AH en ESP KWE bedacht en ontworpen van de studie. KH en JMS uitgevoerd alle experimenten met steun van DL, KP en RS. KH, JS, RS, AH en ESP KWE bijgedragen aan het schrijven van het manuscript.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
