Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die ist ein unterteilte Gerät zu orientieren und zurückhalten Zebrafischlarven. Das Design erlaubt Schweif Durchtrennung und langfristige Sammlung von hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildern der Wundheilung und Regeneration.
Abstract
Der Zebrafisch-Larven ist ein wichtiger Modellorganismus für Entwicklungsbiologie und Wundheilung. Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Larven ein wertvolles System für live hochauflösende mikroskopische Aufnahmen von dynamischen biologischen Phänomene in Raum und Zeit mit zellulären Auflösung. Jedoch kann die traditionelle Methode der Agarose Kapselung für live Imaging Larvalentwicklung und Gewebe nachwachsen behindern. Daher beschreibt die Handschrift der zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die wurde entworfen und hergestellt als funktional unterteilte Gerät Larven für hochauflösende Mikroskopie und erlaubt zu orientieren Schwanzflosse Durchtrennung im Gerät und anschließende hemmungslos Schweif Entwicklung und nachwachsen. Dieses Gerät ermöglicht eine Verwundung und langfristige Bildgebung unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Angesichts der Tatsache, dass die zWEDGI Form 3D gedruckt, die Anpassbarkeit der Geometrien machen es leicht modifiziert für diverse Zebrafisch-imaging-Anwendungen. Darüber hinaus bietet die zWEDGI zahlreiche Vorteile, wie z. B. Zugriff auf die Larve während Experimente für verletzte oder für die Anwendung von Reagenzien, Ausrichtung der mehrere Larven für optimierte Bildgebung und Wiederverwendbarkeit des Geräts parallel geschaltet.
Introduction
Die Regenerationsfähigkeit der Zebrafischlarven Danio Rerio machen sie eine ideale Modellorganismus für Wunde Reaktion sowie Heilung und nachwachsen1,2,3,4zu prüfen. Zugriff auf ein Array von transgenen Zebrafisch Linien und Zebrafisch anatomische Transparenz weiter erhöhen ihre Nützlichkeit für in Vivo Studien der Wunde Antwort Veranstaltungen sowie längerfristige Regenerationsprozesse4. Studie dieser biologischen Prozesse mit Hilfe hochauflösender Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie daher verlangt ein live imaging Zebrafisch-Gerät, das ermöglicht eine hohe Stabilität und nur minimale Bewegungen von Zebrafisch-Larven unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Es ist wichtig, dass das Gerät ermöglicht eine effektive Verwundung und Heilung und Regeneration stattfinden unberührt vom Gerät.
Die standard live imaging Stabilisierungsmethode der Einbettung der Larve in Agarose während der live Aufnahme schränkt Wachstum und Regeneration5 gewickelt und Sterberaten erhöhen kann, da Larven beginnen, um Zeichen der kardiale Stress und Gewebe Nekrose nach vier Stunden-4. Daher entfernen von Agarose aus Regionen von Interesse ist oft notwendig um normale Entwicklung zu ermöglichen und Regeneration6, Freilegung der Larven, um mögliche Schäden als die Agarose wird weggeschnitten. Darüber hinaus muss die Agarose Einbettung Technik, der Benutzer orientieren die Larven in der kurzen Zeit bevor die Agarose5,6,7erstarrt. Schnell manipulieren die Larve erfordert nicht nur Geschick des Benutzers, damit riskiert auch Schäden an der Larve. Obwohl Methoden zur Stabilisierung der Larve für live Imaging beschrieben worden sind, um diese Nachteile, wie z. B. geriffelte Agar Brunnen3 oder Unebenheiten8, umgehen die Verwendung von Silikon Vakuum einfetten erstelle ich eine bildgebende Kammer mit PVC-Rohre oder andere Materialien6und rotatorischen Schlauch9, viele dieser Methoden sind intensive, unordentlich, oft Einweg-labor und Umwelt Manipulation ermöglichen nicht (medikamentöse Behandlungen, verwunden etc..) nach der Montage der Fische.
Deshalb wurde das zWEDGI-Gerät (Abbildung 1) entworfen, um einige der Nachteile des Nährbodens für langfristige live Aufnahmen von Zebrafischlarven während der Manipulation der Probe bei schönem Montage zu überwinden. Die zWEDGI besteht aus drei halboffene unterteilte Kammern (Abbildung 1A) erlauben zum Laden, Zurückhaltung, Verwundung und Bildgebung von 2 bis 4 Tage nach Befruchtung Zebrafisch-Larven. Das Gerät ist hergestellt aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und auf das Deckglas ein 60 mm unten bildgebenden Glasschale gelegt. Der hier vorgestellte Entwurf für heilende Wunde Studien bestimmt war, jedoch die Verwendung eines modularen Design und standard Fertigungstechnologien machen das zWEDGI Design veränderbar und offen für eine Vielzahl von experimentellen Verfahren, vor allem für Verfahren, die erfordert minimale Zurückhaltung mit experimentelle Manipulation und langfristige Bildgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das zWEDGI-Gerät soll 3D Zeitraffer imaging zu stabilisieren und den Fisch in kleine Arbeitsabstand von einem hochauflösenden Mikroskop Ziel orientieren zu erfassen. Während diese Designspezifikationen erfüllt, ist es auch eine Verbesserung gegenüber traditionellen Agar-Basis Vorbereitung für live Imaging. Es gibt drei wichtige Schritte (siehe unten) bei der Herstellung von zWEDGI, die, wenn man nicht richtig Defekte Geräte führen kann:
PDMS-Vorbereitung (Abb. 5A</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte anerkennen, primäre Projektförderung vom Morgridge Institute für Forschung und Labor für optische und Computational Instrumentierung. Wir anerkennen auch Finanzierung von NIH # R01GM102924 (AH und KWE). KH, JMS, RS, AH und KWE konzipiert und gestaltet die Studie. KH und JMS führten alle Experimente mit Unterstützung von DL, KP und RS. KH, JS, RS, AH und KWE trugen zu dem Schreiben des Manuskripts.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
