Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish
Summary
Questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è un dispositivo compartimenti progettato per orientare e trattenere le larve di zebrafish. Il design permette di coda transection e a lungo termine raccolta di immagini di microscopia fluorescente ad alta risoluzione di guarigione delle ferite e la rigenerazione.
Abstract
La larva di pesce zebra è un importante organismo modello per biologia inerente allo sviluppo e per la guarigione della ferita. Ulteriormente, la larva di pesce zebra è un prezioso sistema per live imaging ad alta risoluzione microscopica di fenomeni biologici dinamici nello spazio e nel tempo con cellulare ad alta risoluzione. Tuttavia, il metodo tradizionale di incapsulamento di agarosio per live imaging può ostacolare lo sviluppo larvale e la ricrescita del tessuto. Di conseguenza, questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è stato progettato e fabbricato come un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti per orientare le larve per microscopia ad alta risoluzione permettendo transection pinna caudale all’interno del dispositivo e lo sviluppo successivo coda sfrenato e ricrescita. Questo dispositivo permette di ferimento e a lungo termine imaging mantenendo attuabilità. Dato che la muffa di zWEDGI è stampato in 3D, la possibilità di personalizzazione delle sue geometrie lo rendono facilmente modificati per applicazioni di imaging di zebrafish diversificata. Inoltre, il zWEDGI offre che numerosi vantaggi, quali l’accesso alla larva durante la sperimentazione per ferire o per l’applicazione dei reagenti, parallelo orientamento delle larve multiple per l’imaging snella e riusabilità del dispositivo.
Introduction
La capacità rigenerativa delle larve di zebrafish rerio del Danio li rendono un organismo modello ideale per esaminare la risposta di ferita così come la guarigione e la ricrescita1,2,3,4. Accesso a una serie di linee di zebrafish transgenici e trasparenza anatomica di zebrafish ulteriormente migliorare la loro utilità per gli studi in vivo di ferita risposta eventi, nonché a più lungo termine i processi rigenerativi4. Studio di questi processi biologici mediante microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione di time-lapse pertanto richiede un dispositivo di zebrafish imaging live che consente un’elevata stabilità e minimo movimento della larva zebrafish mantenendo attuabilità. È fondamentale che il dispositivo consente ferendo efficace durante la guarigione e rigenerazione verificarsi inalterato dal dispositivo.
Il metodo di stabilizzazione imaging live standard di incorporare la larva in agarosio durante la formazione immagine diretta limita la crescita e rigenerazione5 di ferita e può aumentare i tassi di mortalità, poiché le larve iniziano a mostrare il segno di necrosi cardiaca lo stress ed il tessuto dopo quattro ore4. Di conseguenza, rimozione di agarosio da regioni di interesse è spesso necessario per consentire il normale sviluppo e rigenerazione6, esponendo le larve alla potenziale danno come l’agarosio è tagliata via. Inoltre, con l’agarosio incorporamento tecnica, l’utente deve orientare le larve nel breve tempo prima l’agarosio si solidifica5,6,7. Rapidamente, manipolando la larva richiede non solo abilità dell’utente, si rischia anche di danni alla larva. Anche se sono stati descritti metodi per stabilizzare la larva per live imaging per ovviare a questi inconvenienti, come agar increspata pozzi3 o divets8, l’uso del vuoto in silicone ungere per creare una camera di imaging con tubazioni in PVC o altro materiali6e rotazione della tubazione9, molti di questi metodi sono labor intensive, disordinato, spesso non riutilizzabili e non consentono per manipolazione ambientale (trattamenti, ferimento di droga ecc.) dopo il pesce è stato montato.
Di conseguenza, il dispositivo zWEDGI (Figura 1) è stato progettato per superare alcuni degli svantaggi di agar di montaggio per l’imaging dal vivo a lungo termine delle larve di zebrafish pur consentendo la manipolazione del campione. Il zWEDGI è costituito da tre alloggiamenti compartimenti semi-aperte (Figura 1A) per consentire per caricamento, moderazione, ferendo e imaging delle larve di zebrafish post-fertilizzazione di 2-4 giorni. Il dispositivo è fabbricato da polidimetilsilossano (PDMS) e inserito il vetrino coprioggetto di un imaging piatto fondo vetro 60 mm. Il progetto qui presentato è stato inteso per gli studi di guarigione della ferita, tuttavia l’uso di un design modulare e tecnologie di fabbricazione standard rendono il design di zWEDGI modificabile e suscettibili di una varietà di procedure sperimentali, soprattutto per le procedure che richiede minima moderazione con manipolazione sperimentale e la formazione immagine a lungo termine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo del dispositivo zWEDGI è quello di catturare il lasso di tempo 3D imaging stabilizzando e orientare il pesce dentro la piccola distanza di lavoro di un obiettivo del microscopio ad alta risoluzione. Durante l’incontro di queste specifiche di progettazione, è anche un miglioramento rispetto tradizionale preparazione a base di agar per imaging dal vivo. Ci sono tre fasi critiche (sotto) nella fabbricazione di zWEDGI, che, se non eseguite correttamente, possono provocare dispositivi difettosi:
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare progetto primario finanziamento dell’Istituto Morgridge per la ricerca e il laboratorio per ottici e strumentazione computazionale. Riconosciamo anche finanziamenti dal NIH # R01GM102924 (AH e KWE). KH, JMS, RS, AH e KWE ideato e realizzato lo studio. KH e JMS effettuati tutti gli esperimenti con supporto da DL, KP e RS. KH, JS, RS, AH e KWE ha contribuito alla stesura del manoscritto.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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