Langsiktig Live bildeenheten forbedret eksperimentelle manipulering av sebrafisk larver
Summary
Dette manuskriptet beskriver zWEDGI (sebrafisk Wounding og Entrapment enhet for vekst og bildebehandling), som er en compartmentalized enhet konstruert for å orientere og holde sebrafisk larver. Design tillater hale transection og langsiktig samling av høyoppløselige fluorescerende mikroskopi bilder av sårheling og gjenfødelse.
Abstract
Sebrafisk Larven er en viktig modell organisme for både utviklingsbiologi og sårtilheling. Videre, sebrafisk Larven er en verdifull system for live høyoppløselig mikroskopiske bildebehandling av dynamisk biologiske fenomener i rom og tid med cellular oppløsning. Den tradisjonelle metoden for agarose innkapsling for live bildebehandling kan imidlertid hindre larver utvikling og vev regrowth. Derfor dette manuskriptet beskriver zWEDGI (sebrafisk Wounding og Entrapment enhet for vekst og bildebehandling), som ble designet og fabrikkert som funksjonelt compartmentalized apparat å orientere Larvene for høy oppløsning mikroskopi mens tillater halefinnen transection innen enheten og påfølgende hemningsløs hale utvikling og re-vekst. Denne enheten gir såret og langsiktig imaging samtidig levedyktighet. Gitt at zWEDGI mold er 3D trykt, customizability sin geometrityper gjør det enkelt endres for mangfoldig sebrafisk tenkelig søknadene. Videre tilbyr zWEDGI mange fordeler, for eksempel tilgang til Larvene under eksperimentering såret eller anvendelsen av reagenser, paralleller retning av flere Larvene for strømlinjeformet bildebehandling og gjenbruk av enheten.
Introduction
Regenerativ kapasitet sebrafisk Larvene Danio rerio gjøre dem en ideell modell organisme for å undersøke såret respons samt healing og gjenvekst1,2,3,4. Tilgang til en rekke transgene sebrafisk linjer og sebrafisks anatomiske transparency ytterligere forsterke deres nytte for i vivo studier av såret svar arrangementer samt langsiktige regenerativ prosesser4. Studiet av disse biologiske prosesser med høy oppløsning time-lapse fluorescens mikroskopi derfor krever en live bildebehandling sebrafisk enhet som gir høy stabilitet og minimal bevegelse av sebrafisk Larven samtidig levedyktighet. Det er viktig at enheten gir effektiv såret mens healing og gjenfødelse oppstår upåvirket av enheten.
Live bildebehandling stabilisering standardmetoden for innebygging Larven i agarose under live bildebehandling begrenser veksten og sår gjenfødelse5 og kan øke dødelighet siden Larvene begynner å vise tegn på cardiac stress og vev nekrose etter fire timer4. Derfor fjerning av agarose fra regioner av interesse er ofte nødvendig å tillate normal utvikling og regeneration6, utsette Larvene til potensielle skader som agarose er kuttet bort. Videre med agarose innebygging teknikk, må brukeren orientere Larvene på kort tid før agarose stivner5,6,7. Raskt manipulere Larven ikke bare krever dyktighet av brukeren, også risiko skade Larven. Selv om metoder for å stabilisere Larven for live bildebehandling har blitt beskrevet for å omgå disse ulempene, som ridged agar brønner3 eller divets8, bruk av silikon vakuum fett for å lage en tenkelig kammer med PVC rør eller andre materialer6og roterende rør9, mange av disse metodene er arbeidskraft intensiv, rotete, ofte ikke-gjenbrukbare og tillater ikke miljømessige manipulering (narkotika behandlinger, såret osv.) etter at fisken har blitt montert.
Derfor ble zWEDGI enheten (figur 1) utviklet for å overvinne noen av ulempene med agar montering for langsiktig live bildebehandling av sebrafisk Larvene mens tillater manipulering av prøven. ZWEDGI består av tre halvåpne compartmentalized kamre (figur 1A) å tillate lasting, tilbakeholdenhet, såret og bildebehandling for 2 til 4 dager etter befruktning sebrafisk larver. Enheten er fabrikkert fra Polydimethylsiloxane (PDMS) og plassert på cover slip av en 60 mm glass bunn tenkelig rett. Design presenteres her var ment for sår helbredelse studier, men bruk av et modulært design og standard fabrikasjon teknologier gjør zWEDGI design kan endres og mottagelig for en rekke eksperimentelle prosedyrer, spesielt for prosedyrer som kreve minimalt tilbakeholdenhet med eksperimentelle manipulasjon og langsiktig bildebehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formålet med zWEDGI enheten er å fange 3D tidsforløp imaging stabilisere og orientere fisken innen de små arbeider fra et høyoppløselig mikroskop mål. Mens møte disse design spesifikasjoner, er det også en forbedring over tradisjonelle agar-baserte forberedelse til live bildebehandling. Det er tre viktige trinn (nedenfor) i produksjon av zWEDGI, som, hvis det ikke gjøres riktig, kan resultere i defekt enheter:
PDMS forberedelse (figur 5A)
<p class="j…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne primære prosjektfinansiering fra Morgridge Institutt for forskning og laboratoriet for optisk og beregningsorientert instrumentering. Vi erkjenner også finansiering fra NIH # R01GM102924 (AH og KWE). KH, JMS, RS, AH og KWE unnfanget og utformet studien. KH og JMS utført alle eksperimenter med støtte fra DL, KP og RS. KH, JS, RS, AH og KWE bidratt til skriving av manuskriptet.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva. JoVE. (88), (2014).
- Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P., Sampath, K., Roy, S. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease. , (2010).
- Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. , (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. JoVE. (95), (2015).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. JoVE. (26), (2009).
- Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure. Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).
- Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays. Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. Second harmonic generation microscopy in zebrafish. Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).
- White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
