A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish
Summary
Este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que é um dispositivo compartimentado, projetado para orientar e restringir as larvas zebrafish. O projeto permite a transecção de cauda e a longo prazo coleção de imagens de alta resolução de microscopia fluorescente de cicatrização e regeneração.
Abstract
A larva de peixe-zebra é um organismo modelo importante para biologia do desenvolvimento e cicatrização de feridas. Além disso, a larva de peixe-zebra é um sistema valioso para ao vivo de alta resolução imagem microscópica dos fenômenos biológicos dinâmicos no espaço e no tempo com resolução de celular. No entanto, o tradicional método de encapsulamento de agarose para geração de imagens ao vivo pode impedir o desenvolvimento larval e regeneração do tecido. Portanto, este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que foi projetado e fabricado como um dispositivo funcionalmente compartimentado para orientar as larvas para microscopia de alta resolução, permitindo transecção da barbatana caudal dentro do dispositivo e desenvolvimento subsequente de cauda desenfreada e re-crescimento. Este dispositivo permite a imagem a longo prazo, mantendo a viabilidade e ferindo. Dado que o molde de zWEDGI 3D impresso, a personalização de suas geometrias torná-lo facilmente modificado para zebrafish diversos aplicativos de imagem. Além disso, o zWEDGI oferece que inúmeros benefícios, tais como o acesso para a larva durante a experimentação ferindo ou para a aplicação de reagentes, em paralelo a orientação de várias larvas para a imagem latente simplificada e reusabilidade do dispositivo.
Introduction
A capacidade regenerativa de larvas de peixe-zebra Danio rerio tornam um organismo modelo ideal examinar a resposta de ferida, bem como a cura e regeneração do1,2,3,4. Acesso a uma matriz de linhas zebrafish transgênicos e anatômica transparência do zebrafish ainda mais aumentar sua utilidade para estudos em vivo da ferida resposta eventos, bem como de longo prazo processos regenerativos4. O estudo desses processos biológicos usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de alta resolução, portanto, exige um dispositivo de zebrafish imagens ao vivo que permite alta estabilidade e movimento mínimo da larva zebrafish, mantendo a viabilidade. É a chave que o dispositivo permite ferindo eficaz enquanto cura e regeneração ocorrer não afetado pelo dispositivo.
O padrão método estabilização de imagens ao vivo de incorporar a larva em agarose durante a imagem latente ao vivo restringe o crescimento e ferida regeneração5 e pode aumentar as taxas de morte uma vez que as larvas começam a mostrar sinais de necrose de tecido e estresse cardíaco após quatro horas4. Portanto, a remoção de agarose de regiões de interesse é muitas vezes necessária para permitir o desenvolvimento normal e regeneração6, expondo as larvas de dano potencial, como o agarose é cortar fora. Além disso, com o agarose incorporação técnica, o usuário deve orientar as larvas em curto espaço de tempo antes que a agarose solidifica5,6,7. Rapidamente manipulando a larva requer não apenas a habilidade do usuário, também corre o risco de danos para a larva. Embora métodos para estabilizar a larva para geração de imagens ao vivo têm sido descritos para contornar estes inconvenientes, tais como agar estriadas poços3 ou divets8, o uso do vácuo do silicone graxa para criar uma imagem de câmara com tubulação de PVC ou outro materiais6e rotacional tubo9, muitos destes métodos são de trabalho intensivo, desarrumado, muitas vezes não recuperável e não permitir a manipulação ambiental (tratamentos, ferindo de drogas etc.) depois que o peixe tem sido montado.
Portanto, o dispositivo de zWEDGI (Figura 1) foi projetado para superar algumas das desvantagens de ágar de montagem para a imagem latente ao vivo a longo prazo de larvas de zebrafish permitindo a manipulação da amostra. O zWEDGI consiste de três semi-aberto compartimentadas câmaras (figura 1A) para permitir para carregamento, retenção, ferindo e imagem latente de larvas de zebrafish pós fertilização de 2 a 4 dias. O dispositivo é fabricado a partir de polidimetilsiloxano (PDMS) e colocado a lamínula de um prato de imagem de 60 mm vidro inferior. O projeto apresentado aqui foi destinado para estudos de cura ferida, no entanto o uso de um design modular e tecnologias de fabricação padrão fazer o design de zWEDGI modificável e passível de uma variedade de procedimentos experimentais, especialmente para os procedimentos que exigir a retenção mínima com manipulação experimental e imagem a longo prazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A finalidade do dispositivo zWEDGI é capturar o lapso de tempo 3D estabilizando e orientando os peixes dentro a pequena distância de trabalho de um objectivo de microscópio de alta resolução de imagem. Ao mesmo tempo atender a estas especificações de projeto, acabou também uma melhoria tradicional baseada em ágar preparação para geração de imagens ao vivo. Existem três passos críticos (abaixo) na fabricação do zWEDGI, que, se não for feito corretamente, pode resultar em dispositivos com defeito:
<p …Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer o projeto principal financiamento do Instituto Morgridge para pesquisa e o laboratório de óptica e instrumentação computacional. Reconhecemos também que o financiamento do NIH # R01GM102924 (AH e KWE). KH, JMS, RS, AH e KWE concebido e desenvolvido o estudo. KH e JMS executada todas as experiências com o apoio do DL, KP e RS. KH, JS, RS, AH e KWE contribuiram para a escrita do manuscrito.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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