Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra
Summary
Este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que es un dispositivo compartimentado diseñado para orientar y restringir las larvas de pez cebra. El diseño permite el corte transversal de la cola y a largo plazo colección de imágenes de alta resolución microscopia fluorescente de la cicatrización de heridas y regeneración.
Abstract
Las larvas de pez cebra son un organismo modelo importante para la biología del desarrollo y la cicatrización de heridas. Además, la larva de pez cebra es un sistema valioso vivo alta resolución imagen microscópica de fenómenos biológicos dinámicos en el espacio y tiempo con resolución de celular. Sin embargo, el tradicional método de encapsulación de agarosa para la proyección de imagen vivo puede impedir desarrollo larval y crecimiento del tejido. Por lo tanto, este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que fue diseñado y fabricado como un dispositivo funcionalmente compartimentado para orientar las larvas para microscopía de alta resolución permitiendo corte transversal de la aleta caudal dentro del dispositivo y desarrollo posterior cola libre y nuevo crecimiento. Este dispositivo permite herir y la proyección de imagen a largo plazo manteniendo la viabilidad. Dado que el molde de zWEDGI es impreso en 3D, la personalización de sus geometrías hacen fácilmente modificadas para aplicaciones diversas de pez cebra. Además, el zWEDGI ofrece que numerosas ventajas, como el acceso a la larva durante la experimentación para herir o para la aplicación de reactivos, paralelo orientación de múltiples larvas para la proyección de imagen optimizada y reutilización del dispositivo.
Introduction
La capacidad regenerativa de las larvas de pez cebra Danio rerio hacen un organismo modelo ideal para examinar la herida así como sanación y regeneración1,2,3,4. Acceso a un conjunto de líneas de pez cebra transgénico y transparencia anatómica de pez cebra más mejorar su utilidad para los estudios en vivo de eventos de respuesta herida, así como a más largo plazo de procesos regenerativos4. Estudio de estos procesos biológicos usando microscopía de fluorescencia Time-lapse alta resolución por lo tanto exige un dispositivo de pez cebra imagen vivo que permite gran estabilidad y un mínimo movimiento de la larva de pez cebra manteniendo la viabilidad. Es clave que el dispositivo permite herir eficaz mientras cura y regeneración ocurrir inafectado por el dispositivo.
El método de estabilización imagen vivo estándar de incrustar la larva en agarosa durante proyección de imagen vivo restringe el crecimiento y regeneración5 la herida y puede aumentar las tasas de mortalidad ya que las larvas comienzan a mostrar signos de necrosis cardiaca de estrés y el tejido después de cuatro horas4. Por lo tanto, retiro de agarosa de regiones de interés es a menudo necesario para permitir el desarrollo normal y regeneración6, exponer las larvas a posibles daños como la agarosa es corta. Además, con la agarosa incorporación técnica, el usuario debe orientar las larvas en el corto tiempo antes de que la agarosa solidifica5,6,7. Rápidamente no sólo manipular la larva requiere habilidad del usuario, también corre el riesgo de daño a la larva. Aunque se han descrito métodos para estabilizar la larva viva imagen para sortear estos inconvenientes, tales como agar rugoso pozos3 o divets8, el uso de vacío de silicona grasa para crear una cámara de proyección de imagen con tubería de PVC u otros materiales6tubo rotatorio9, muchos de estos métodos son de mano de obra intensiva, desordenada, a menudo no reutilizables y no permitir manipulación ambiental (tratamientos, hiriendo la droga etcetera.) después de que el pescado se ha montado.
Por lo tanto, el dispositivo de zWEDGI (figura 1) fue diseñado para superar algunos de los inconvenientes del agar de montaje para a largo plazo en la proyección de imagen de larvas de pez cebra permitiendo la manipulación de la muestra. La zWEDGI consiste en tres cámaras compartimentadas semi abiertos (figura 1A) para permitir la carga, sujeción, hiriendo y proyección de imagen de las larvas de pez cebra de fertilización después de 2 a 4 días. El dispositivo está fabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) y coloca sobre el cubreobjetos de un plato de 60 mm cristal inferior. El diseño presentado aquí fue pensado para estudios de curación de herida, sin embargo el uso de un diseño modular y tecnologías de fabricación estándar hacer el diseño de zWEDGI modificable y susceptible a una variedad de procedimientos experimentales, especialmente para los procedimientos que requieren moderación mínima manipulación experimental y la proyección de imagen a largo plazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El propósito del aparato zWEDGI es capturar 3D lapso por estabilizar y orientar el pescado dentro de la pequeña distancia de un objetivo de microscopio de alta resolución de imagen. Cumpliendo con estas especificaciones de diseño, es también una mejora sobre la preparación tradicional de base de agar para la proyección de imagen vivo. Hay tres pasos fundamentales (abajo) en la fabricación de la zWEDGI, que, si no hecho correctamente, puede resultar en aparatos defectuosos:
Preparación…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el proyecto principal financiación del Instituto Morgridge para la investigación y el laboratorio de óptica e instrumentación computacional. También reconocemos que la financiación de los NIH # R01GM102924 (AH y KWE). KH, JMS, RS, AH y KWE concibieron y diseñado el estudio. KH y JMS realizó todos los experimentos con la ayuda de DL, KP y RS. KH, JS, RS, AH y KWE contribuyen a la redacción del manuscrito.
Materials
| Fabricate molds | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA 3D printer | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Accura 60 photopolymer resin | 3D Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| denatured alcohol | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| UV post cure apparatus | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| TouchNTuff nitrile gloves | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| borosilicate glass disc, 2" diameter | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| ultrasonicator cleaner | Branson | 1510R-MTH | |
| isopropyl rubbing alcohol 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz clear plastic cup | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| 6"craft stick | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adhesives |
| 10mL syringe | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| desiccator | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in ratcheting bar clamp | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| lab oven | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| tweezer set | Aven | 549825 | McMaster-Carr |
| compressed air filtered nozzle | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| vacuum bench vise | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| 55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Loading Larvae | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Transfer pipette | Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific |
| powdered skim milk | 2902887 | MP Biomedicals | |
| double distilled water | |||
| N-phenylthiorurea | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (dry bath incubator) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| large orifice pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | Fisher Scientific |
| General purpose pipette tip, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 scalpel blade | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G syringe needle | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| inverted microscope | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
References
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