Påvisning av sjeldne mutasjoner i CtDNA med neste generasjons sekvensering
Summary
Dette manuskriptet beskriver en teknikk for å oppdage mutasjoner lavfrekvente i ctDNA, ER-Seq. Denne metoden skiller seg ut med sin unike bruk av toveis feilretting, spesielle bakgrunn filter og effektiv molekylær oppnåelse.
Abstract
Analyse av sirkulerende svulst DNA (ctDNA) med neste generasjons sekvensering (NGS) har blitt et verdifullt verktøy for utvikling av clinical onkologi. Anvendelsen av denne metoden er imidlertid utfordrende på grunn av sin lav sensitivitet i å analysere spor mengden ctDNA i blodet. Metoden kan videre generere falske positive og negative resultater fra denne sekvensering og påfølgende analyse. For å forbedre det gjennomførbarhet og pålitelig ctDNA gjenkjenning i klinikken, presenterer her vi en teknikk som beriker sjeldne mutasjoner for sekvensering, berike sjeldne mutasjon sekvensering (ER-Seq). ER-Seq kan skille en enkelt mutasjon av 1 x 107 vill-type nukleotider, som gjør det en lovende verktøyet å merker ekstremt lavfrekvente genetiske endringer og dermed vil være svært nyttig i å studere sykdom heterogenicity. I kraft av unike sekvensering kortets hemorroider gjør denne metoden en effektiv utvinning av ctDNA molekyler, mens på samme tid korrigerer for feil bidirectionally (følelse og antisense). Vårt utvalg av 1021 kb sonder beriker måling av Målrett mot regioner som dekker over 95% av svulst-relaterte driveren mutasjoner i 12 svulster. Dette kostnadseffektive og universelle gjør en entydig vellykket akkumulering av genetiske data. Etter effektivt filtrere ut bakgrunn feil, finner nettopp ER-seq sjeldne mutasjoner. Bruker en case-studie, presenterer vi en detaljert protokoll demonstrere sonde design, bibliotek konstruksjon og målet DNA fange metoder, mens også inkludert data analyse arbeidsflyten. Prosessen for å utføre denne metoden vanligvis tar 1-2 dager.
Introduction
Neste generasjons sekvensering (NGS), et kraftig verktøy for å undersøke mysterier genomet, kan gi en stor mengde informasjon som kan avsløre genetiske endringer. Programmet NGS analyse i klinikken er blitt mer vanlig, spesielt for personlige medisin. En av de største begrensningene av NGS, er imidlertid en høy feil. Selv om det anses egnet for studere arvet mutasjoner, er analyse av sjeldne mutasjoner sterkt begrenset1,2, spesielt når analysere DNA fått fra en “flytende biopsi”.
Sirkulerende svulst er DNA (ctDNA) cellen gratis DNA (cfDNA) i blodet som er utgytt fra kreftceller. I de fleste tilfeller er antallet ctDNA ekstremt lav, som gjør sin deteksjon og analyse svært utfordrende. CtDNA har imidlertid mange attraktive funksjoner: isolasjonen er minimal invasiv, det kan påvises i de tidlige stadiene av tumor vekst, ctDNA nivået viser effektivitet og ctDNA inneholder DNA mutasjoner i både primær og metastatisk lesjoner 3 , 4 , 5. derfor gitt den raske utviklingen av NGS teknikk og analyse, programmet av ctDNA er blitt mer attraktiv.
Forskjellige massivt parallelle sekvenser tilnærminger har vært benyttet for ctDNA gjenkjenning, men ingen av disse metodene har blitt akseptert for rutinemessig bruk i klinikker på grunn av sine begrensninger: lav følsomhet, mangel på allsidighet og en relativt høy pris6 ,7,8. For eksempel dobbeltsidig sekvensering, basert på en unik identifikator kode (UID), gjentatte ganger retter opp feil i konsensus bidirectionally, rette opp de fleste sekvensering feil. Muligheten for denne metoden er imidlertid tapt på grunn av sin høye og lave utnyttelse9,10. Tilsvarende har større praktiske i CAPP-Seq og dens forbedret gjentakelse CAPP-IDES11,12, i cfDNA deteksjon, om nøyaktighet og universalitet av metodene må forbedres.
For å møte trenger til nøyaktig ctDNA deteksjon og analyse, utviklet vi en ny strategi, berike sjeldne mutasjon sekvensering det (ER-Seq). Denne tilnærmingen kombinerer følgende: unik sekvensering adaptere effektivt gjenopprette ctDNA molekyler, med toveis feilretting og muligheten til å skille en enkelt mutasjon av > 1 × 107 vill-type nukleotider; 1021 kb sonder som beriker måling av Målrett mot regioner som dekker over 95% av svulst-relaterte mutasjoner fra 12 svulster, herunder lungekreft, tykktarmskreft, magekreft, brystkreft, nyrekreft, bukspyttkjertelkreft, leverkreft, kreft i skjoldbruskkjertelen, livmorhalskreft, esophageal kreft og endometrial karsinom (tabell 1); og opprinnelige databasen screening gjør det effektivt og enkelt å nøyaktig oppdage sjeldne mutasjoner i ctDNA.
For å bygge en planlagt database, kan du finne alle genet mutasjoner av ER-Seq fra en rekke samme type prøver (~ 1000 i begynnelsen). Disse virkelige mutasjoner må bekreftes av flere pålitelig gjenkjenningsmetoder og analyse. Deretter oppsummere mønster av falske mutasjoner og klynge alle falske mutasjoner å bygge første opprinnelige databasen. Fortsett å legge til falske mutasjoner funnet fra påfølgende sekvensering eksperimenter til denne databasen. Derfor blir denne planlagte databasen en dynamisk utvidet database som betydelig forbedrer sekvensering nøyaktighet.
For å fremme fremgang i svulst diagnostikk og overvåking, presenterer vi ER-Seq, en lav kostnad og mulig metode for oppkjøpet av universelle. Vi presenterer en studie som gjennomgikk ER-Seq analyse, demonstrere nøyaktigheten for å oppdage sjeldne mutasjoner og muligheten for bruk i klinikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksistensen av sirkulerende svulst DNA (ctDNA) ble oppdaget mer enn 30 år siden, men anvendelsen av ctDNA analyser er fortsatt ikke rutinemessig i klinisk praksis. Interesse i praktisk anvendelse av ctDNA metoder har økt med utviklingen av teknologi for ctDNA deteksjon og analyse. Svulst avlytting med ctDNA tilbyr en minimal-invasiv tilnærming for vurdering av mikroskopiske gjenværende sykdom, svar på terapi, og svulst molekylær profiler under bakgrunn av svulst evolusjon og intratumoral heterogenitet<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av Geneplus-Beijing Institute.
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A., Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
