Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni
Summary
Questo articolo descrive un protocollo per l’isolamento axenica su larga scala e la raccolta di nuotare liberamente miracidia del trematode umano sangue Schistosoma mansoni e la loro successiva elaborazione per l’introduzione in coltura in vitro .
Abstract
Umani sangue trematodi, Schistosoma spp., hanno un ciclo di vita complesso che coinvolge fasi dello sviluppo sessuale e asessuale all’interno di un lumaca intermedi e di mammifero ospite finale, rispettivamente. La capacità di isolare e sostenere le fasi del ciclo di vita diverso in condizioni di coltura in vitro ha notevolmente facilitato le indagini dei meccanismi cellulari, biochimici e molecolari che regolano l’host, la sviluppo e la crescita del parassita interazioni farmacologiche. Trasmissione della schistosomiasi richiede la riproduzione asessuata e lo sviluppo di più stadi larvali all’interno dell’host lumaca; dal miracidium infettiva, attraverso sporocisti primarie e secondarie, alla fase finale cercarial che è infettivo agli esseri umani. In questa carta presentiamo un protocollo passo-passo per massa schiusa e isolamento di Schistosoma mansoni miracidia da uova ottenute dai fegati di topi infetti e la loro successiva introduzione in coltura in vitro . Si prevede che il protocollo dettagliato incoraggerà nuovi ricercatori per partecipare e ampliare questo importante settore della ricerca di schistosome.
Introduction
L’essere umano sangue flukes Schistosoma spp., sono gli agenti causali della schistosomiasi, una malattia tropicale trascurata che affligge un stimato 230 milioni di persone in tutto il mondo1. La specie più diffusa, Schistosoma mansoni, è geograficamente distribuita in Sud America, l’arcipelago dei Caraibi, Medio Oriente e Africa sub-sahariana2. Il ciclo di vita di S. mansonie altri schistosomes, è complesso, che coinvolge un mammifero ospite definitivo e lumache d’acqua dolce del genere Biomphalaria che fungono da ospiti intermedi obbligati.
S. mansoni adulto maschio e femmina a vite senza fine coppie vivono nelle vene mesenteriche posteriore di riprodurre il mammifero ospite, determinando il rilascio di uova embrionate (ovuli) che sono alloggiati in piccole venule della mucosa intestinale. Uova quindi rotture attraverso le pareti del vaso, migrano attraverso il tessuto mucoso e alla fine inserire il lume intestinale dove essi sono annullate con le feci. Quando gli ovuli digitare tratteggio di larve d’acqua dolce e liberamente natante (miracidia), devono, in breve tempo, trovare una lumaca Biomphalaria adatta per infettare al fine di continuare il suo ciclo di vita. Questo processo di infezione coinvolge miracidial attaccamento alla superficie esterna di lumaca seguita da penetrazione attiva e voce della larva nell’ospite. Presto dopo l’entrata, il miracidium inizia a capannone relative piastre epidermiche ciliati esterni come si forma un sincizio che diventerà la nuova superficie esterna (tegumento) della prossima fase larvale, lo sporociste primario o madre. Attraverso la riproduzione asessuata, ogni sporociste primario produce e rilascia una seconda generazione di sporocisti, definiti secondari o sporocisti di figlia, che a sua volta, generano e rilasciare grandi quantità di intramolluscan fase finale, le cercarie di Fasciolopsis3 . Al momento della fuga dall’host lumaca, liberamente natante cercarie sono capaci di associare a e direttamente penetrando la pelle di un uomo o altri host mammiferi adatto. All’entrata in loro nuovo ospite, cercarie trasformano alla fase schistosomula parassitarie e invadono il sistema vascolare. Essi, a loro volta, migrare al polmone e quindi alla vena epatica dove maturano in vermi adulti, formano coppie maschili e femminile e viaggiare a vene mesenteriche per completare il loro ciclo di vita.
Successo intramolluscan o “fase di lumaca” sviluppo larvale schistosomes è essenziale per la continuazione del ciclo di trasmissione interumana host-to-host. Di fondamentale importanza è la seguente voce periodo del miracidium liberamente natante in host lumaca e la sua trasformazione iniziale alla fase primaria sporociste. A seconda della compatibilità fisiologica e immunologica tra ospite e parassita, è durante questa fase di sviluppo larvale che iniziale successo o il fallimento di stabilire infezioni è determinato4,5,6 . Lo sviluppo successivo di sporocisti primari in grado di produrre asessualmente sporocisti secondari, che quindi generano cercarie umani-infettivo, ulteriormente richiedono un ambiente di host fisiologico permissiva che fornisce per tutta crescita del parassita e riproduttiva ha bisogno.
Fin qui, piccolo è conosciuto circa il sottostante fisiologici, biochimici e processi molecolari controllare interazioni di schistosome-lumaca, soprattutto le molecole e vie coinvolte nella regolazione della riproduzione e sviluppo larvale o modulante risposta immune dell’ospite. Pronto accesso a un gran numero di questi stadi larvali in vitro condizioni di coltura che permettono la manipolazione sperimentale faciliterebbe notevolmente alla scoperta delle vie di sviluppo e meccanismi di fondo della crescita cellulare, differenziazione e riproduzione. Percorsi critici parassita o meccanismi, identificati attraverso la sperimentazione in vitro , quindi potrebbero essere utilizzati per interrompere la crescita/riproduzione larvale nell’host di lumaca, o per identificare meccanismi immuni dell’ospite lumaca coinvolti nel riconoscimento e nell’eliminazione di fasi miracidial o sporociste.
In questo articolo e il video di presentazione, forniamo una descrizione dettagliata di un metodo per isolare un numero elevato di nuotare liberamente S. mansoni miracidia per introduzione nella cultura in vitro che poi può essere sottoposto a follow-up sperimentale manipolazione (vedere la Figura 1 per una descrizione schematica del flusso di lavoro di protocollo). Anche se le procedure simili sono state descritte in precedenza7,8,9, abbiamo sentito che un protocollo dettagliato sarebbe utile per i ricercatori che desiderano impiegare questo modello per affrontare domande ancora senza risposta legate alla lo sviluppo larvale intramolluscan, proliferazione cellulare e interazioni immuni di schistosome-lumaca. Inoltre, questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l’isolamento delle uova da altri trematodi medicamente importanti quali vescica-dimora S. haematobium, distomi del fegato o trematodi del polmone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia di S. mansoni, isolato e manipolato come descritto nel presente documento, può infettare solo l’ospite intermedio di lumaca e pertanto non rappresentano un rischio biologico umano durante questa fase di sviluppo larvale. Tuttavia, per evitare l’accidentale esposizione/infezione di lumache, dovrebbe prestare attenzione per eseguire gli isolamenti miracidial in una posizione diversa dalle zone dove la specie di lumaca Biomphalaria sensibili possono essere presente o mantenuto. Una stanza separa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziato in parte dalla concessione NIH RO1AI015503. Topi infettati di schistosome erano forniti dal NIAID schistosomiasi Resource Center presso l’Istituto di ricerca biomedica (Rockville, MD) attraverso NIH-NIAID contratto HHSN272201000005I per la distribuzione attraverso le risorse della BEI.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
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