대량 절연 및 인간의 혈액 우연 Schistosoma Mansoni 의 Intramolluscan 단계의 생체 외에서 재배
Summary
이 문서에서는 대규모 axenic 분리와 인간의 혈액 요 행 Schistosoma mansoni 의 free-swimming miracidia의 컬렉션에 대 한 프로토콜 및 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 그들의 후속 처리.
Abstract
인간의 혈액 마리가, Schistosoma 종, 달팽이 중급 및 포유류 최종 호스트, 내 성적, 성적 발달 단계를 각각 포함 하는 복잡 한 수명 주기 있다. 격리 하 고 생체 외에서 문화 조건 하에서 다른 라이프 사이클 단계를 유지 하는 능력은 크게 기생충 성장, 개발 및 호스트 통제 세포, 생화학 및 분자 메커니즘의 조사를 촉진 상호 작용입니다. 전송 schistosomiasis의 성별이 없는 재생산 및 달팽이 호스트; 내에서 여러 개의 애벌레 단계 개발 필요 기본 및 보조 sporocysts 통해 infective miracidium에서 cercarial 막바지에 그것은 인 간에 게 감염입니다. 이 문서에서 우리는 대량 해칭 및 감염 된 마우스, 그리고 생체 외에서 문화에 그들의 연속적인 소개의 간은에서 얻은 달걀에서 Schistosoma mansoni miracidia의 격리에 대 한 단계별 프로토콜 제시. 자세한 프로토콜에 종사 schistosome 연구의이 중요 한 분야를 확대 하는 새로운 연구를 격려 할 것 이다 예상 됩니다.
Introduction
인간의 혈액 마리가 Schistosoma 종, schistosomiasis, 한 약된 230 백만 사람들 전세계1afflicting 소홀히 열 대 질병의 원인이 되는 에이전트입니다. 가장 광범위 한 종, Schistosoma mansoni, 지리적으로 남아메리카, 카리브 제도, 중동, 사하라 사막 이남의 아프리카2에 배포 됩니다. S. mansoni, 다른 schistosomes의 수명 주기는 복잡 하다, 포유류 확실 한 호스트 및 의무 중간 호스트 역할 속 Biomphalaria 의 민물 달팽이.
S. mansoni 남성과 여성의 성인 웜은 쌍 창 자 점 막의 작은 venules에 박 혀 되 embryonated 계란 (ova)의 출시에 따른 포유류 호스트 재현의 후부 mesenteric 정 맥에서 생활 합니다. 계란 다음 혈관 벽을 통해 휴식 점 막 조직을 통해 마이그레이션 하 고 결국 대변으로 무효 처리는 어디 장 루멘을 입력 합니다. Ova는 민물 및 free-swimming 애벌레 (miracidia) 해치를 입력, 그들은 해야 합니다, 짧은 순서로 찾아 감염의 수명 주기를 계속 하기 위해 적당 한 Biomphalaria 달팽이. 이 감염 과정 miracidial 첨부 파일을 달팽이 외부 몸 표면 활성 침투와 유 충의 항목 호스트에 다음을 포함 한다. 항목, 직후는 miracidium 다음 애벌레의 단계로, 기본 또는 어머니 sporocyst의 새로운 외부 표면 (tegument) 될 것 이다 syncytium 형성으로 그것의 외부 ciliated 상피 접시를 발산 하기 시작 합니다. 성별이 없는 재생산을 통해 각 기본 sporocyst 생성 하 고 보조 나 sporocysts 또는 딸 sporocysts, 차례 차례로, 생성 하 고 intramolluscan 결선, cercaria3 의 다 수 출시의 2 세대를 출시 . 달팽이 호스트에서 탈출, 따라 free-swimming cercariae를 연결 하 고 직접 인간 또는 다른 적합 한 포유류 호스트의 피부를 관통 할 수 있다. 그들의 새로운 주인으로 입국, 시 cercariae 기생 schistosomula 단계로 변환 하 고 혈관 시스템을 침공. 그들은, 차례 차례로, 폐 그리고 그들이 어른 벌레로 성숙, 남성과 여성의 쌍을 형성 하 고 그들의 수명 주기를 완료 하는 데 mesenteric 정 맥에 여행 간 정 맥을 마이그레이션합니다.
성공 intramolluscan 또는 “달팽이 단계” 개발 애벌레 schistosomes의 인간의 호스트-전송의 사이클의 지속에 필수적 이다. 중요 한 중요성의 달팽이 호스트와 기본 sporocyst 단계에 그것의 초기 변화에 free-swimming miracidium의 기간 다음 항목이입니다. 호스트와 기생충 간의 생리 및 면역학 호환성에 따라 그것은 애벌레의 개발의이 단계는 초기 성공 또는 실패 결정된4,5,6 감염을 설치 하 . 기본 sporocysts asexually 다음에 인간 infective cercariae 생성, 보조 sporocysts 생산 능력의 후속 개발 추가 모든 기생충의 성장을 제공 하는 관대 한 생리 호스트 환경을 요구 하 고 생식이 필요합니다.
날짜 하려면, 작은 기본 생리, 생화학에 대 한 알려져 있다 및 분자 과정 schistosome-달팽이 상호 작용 제어, 애벌레의 개발 및 재생산, 규제 또는 조절에 관여 하는 특히 분자 및 경로 호스트 면역 응답입니다. 준비에 대 한 액세스 조건 하에서 생체 외에서 문화 실험 조작을 허용 하는이 애벌레 단계의 많은 것 크게 용이 하 게 개발 통로의 발견 및 세포 성장, 감 별 법의 기본 메커니즘 그리고 재생산입니다. 중요 한 기생충 경로 또는 메커니즘, 생체 외에서 실험을 통해 확인 된 다음 사용할 수 애벌레 성장/달팽이 호스트에서 복제를 중단 하거나 달팽이 호스트 면역 메커니즘 인식과의 제거에 관련 된 식별 miracidial 또는 sporocyst 단계.
이 문서 및 비디오 프레 젠 테이 션, free-swimming S. mansoni 의 많은 수를 분리 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 후속 실험 대상이 될 수 있습니다 생체 외에서 문화에 대 한 소개에 대 한 miracidia 조작 (프로토콜 워크플로의 도식 개요 그림 1 참조). 비슷한 절차 설명 되어 있지만 이전7,,89, 우리 상세한 프로토콜 관련이 아직도 대답 없는 질문을 해결 하기 위해이 모델을 채용 하고자 하는 연구자에 유용할 느꼈다 intramolluscan 애벌레 발달, 세포질 확산, 그리고 schistosome-달팽이 면역 상호 작용. 또한,이 이렇게 쉽게 방광-아리 스토 S. haematobium, 간 마리가 또는 폐 마리가 같은 다른 의학적으로 중요 한 흡 충 류에서 계란의 격리에 대 한 적응 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. mansoni, 절연 및 여기에 설명 된 대로 조작의 Miracidia만 달팽이 중간 호스트를 감염 시킬 수 있습니다 그리고 그러므로 애벌레 발달의이 단계 동안 인간의 생물 학적 변하지 않습니다. 그러나, 감염을 피하기 위해 사고 노출/달팽이의 배려는 감염 Biomphalaria 달팽이 종 수 있습니다 존재 또는 유지 하는 지역에서 다른 위치에 miracidial 격리를 수행 하기 위해가지고 한다. BSL2 공간으로, 등…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH 그랜트 RO1AI015503에 의해 일부를 투자. Schistosome에 감염 된 쥐 바이 리소스를 통해 배포에 대 한 NIH NIAID 계약 HHSN272201000005I 통해 NIAID Schistosomiasis 리소스 센터 생물 의학 연구소 (락 빌, 메릴랜드)에 의해 제공 되었다.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
