Массовые изоляции и культивирования In Vitro Intramolluscan стадий человеческой крови Fluke Schistosoma Mansoni
Summary
Эта статья описывает протокол для крупных стерильных изоляции и коллекции свободноплавающих miracidia человеческой крови fluke Schistosoma mansoni и их последующей обработки для введения в культуру в пробирке .
Abstract
Человеческой крови сосальщики, Шистосомы spp., имеют сложный жизненный цикл, который включает бесполыми и сексуальной фаз развития внутри улитки промежуточные и млекопитающих окончательного хозяина, соответственно. Способность изолировать и поддерживать различные жизненного цикла этапов в vitro условиях культура в значительной степени способствовало расследований сотовой, биохимических и молекулярных механизмов, регулирующих паразита роста, развития и принимающих взаимодействий. Передача о шистосомоза требует бесполое размножение и развитие нескольких личиночных стадий в узле Улитка; от инфекционных miracidium, через первичных и вторичных sporocysts, в cercarial стадии, инфекционный для людей. В этой статье мы представляем пошаговые протокол для массового штриховки и изоляции Schistosoma mansoni miracidia из яйца, полученные от печень инфицированных мышей, и их последующее введение в культуру в пробирке . Предполагается, что подробный протокол будет поощрять новых исследователей заниматься и расширения этой важной области schistosome исследований.
Introduction
Человека кровь сосальщики Schistosoma spp., уже возбудителей о шистосомоза, забытых тропических болезней, от которых страдает примерно 230 миллионов человек во всем мире1. Наиболее распространенных видов, Schistosoma mansoni, географически распределены в Южной Америке, Карибском архипелаге, Ближнем Востоке и к югу от Сахары Африке2. Жизненный цикл S. mansoniи другие шистосомоз, сложные, включающие млекопитающих принимающей окончательные и пресноводных улиток род Biomphalaria , которые служат в качестве облигатного промежуточных хозяев.
S. mansoni мужского и женского взрослого червя пар, живущих в задней брыжеечных вен воспроизводить млекопитающих хост, что привело к освобождению эмбриональные яйца (равнина), которые становятся подал в небольшой венул слизистой оболочки кишечника. Яйца, а затем перерывы через стенки сосудов, мигрируют через слизистых тканей и в конечном итоге введите просвета кишечника, где они будут аннулированы с калом. Когда яйцеклетки введите штрих пресной воды и свободноплавающих личинки (miracidia), они должны в короткие сроки, найти подходящую Biomphalaria улитки, чтобы заразить для того чтобы продолжать его жизненного цикла. Этот процесс инфекции включает miracidial привязанность к улитки космическое тело поверхности следуют активного проникновения и вход личинка в хозяина. Вскоре после вступления miracidium начинает проливать его внешней мерцательного эпидермального пластины, как он образует синцития, которая станет новой внешней поверхности (оболочки) следующий личиночной стадии первичной или мать Спороциста. Бесполое размножение каждой первичной Спороциста производит и выпускает второго поколения sporocysts, называют вторичные или дочь sporocysts, которые в свою очередь, создания и выпуска большого числа intramolluscan стадии, видовой3 . После побега из узла Улитка свободноплавающих cercariae способны подключения и непосредственно проникая кожи человека или другие подходящие млекопитающих хоста. После вступления в их новый хост cercariae преобразование на паразитарные schistosomula сцену и вторгнуться в сердечно-сосудистой системы. Они, в свою очередь, мигрируют в легких, а затем печеночной вены, где они Зрелые для взрослых червей, образуют мужских и женских пар и поехать брыжеечных вен для завершения их жизненного цикла.
Успех intramolluscan или «улитка этап» развитие личинок шистосомоз имеет важное значение для продолжения цикла человека хост узел передачи. Критически важное значение имеет период следующую запись свободноплавающих miracidium в узле улитки и превращение его ранних до стадии первичной Спороциста. В зависимости от физиологического и иммунологическая совместимость между хозяином и паразитом именно во время этой фазы развития личинок что первоначальный успех или неудача для установления инфекции определяется4,5,6 . Последующее развитие первичных sporocysts бесполым производить вторичные sporocysts, которые затем генерировать человека инфекционный cercariae, далее требуют разрешительной физиологических хост-среды, которая обеспечивает для всех паразита роста и репродуктивных потребностей.
На сегодняшний день мало что известно о лежащих в основе физиологических, биохимических и молекулярных процессов управления schistosome Улитка взаимодействия, особенно на молекулы и тропинки участвует в регулировании развития личинок и воспроизводства, или модулирующая хоста иммунных реакций. Свободный доступ к большое количество этих личиночной стадии в vitro условиях культуры, которые позволяют экспериментальных манипуляций значительно облегчит обнаружение пути развития и основных механизмов роста клеток, дифференциация и размножение. Критические паразита пути или механизмов, выявленных с помощью экспериментов в пробирке , может затем использоваться для нарушить личиночной роста/воспроизведение в узле Улитка, или для идентификации Улитка хост иммунные механизмы признания и ликвидации miracidial или Спороциста этапов.
В этой статье и видео презентации, мы предоставляем подробное описание метода для изоляции большого числа свободноплавающих S. mansoni miracidia для введения в культуру в пробирке , который затем может быть подвергнут последующих экспериментальных манипуляция (см. рис. 1 на Схематический обзор протокола рабочего процесса). Хотя аналогичные процедуры были описаны ранее7,8,9, мы чувствовали, что подробный протокол будет полезным для исследователей, которые хотят использовать эту модель для решения до сих пор без ответа вопросы, связанные с intramolluscan развития личинок, пролиферации и schistosome Улитка иммунных взаимодействий. Кроме того этот подход может быть легко адаптирована для изоляции яиц от других медицински важных трематоды мочевого пузыря жилья S. haematobium, печень сосальщиков или легких сосальщики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia S. mansoni, изолированные и манипулировать, как описано в настоящем документе, может заразить только Улитка промежуточного узла и поэтому не представляют человека биологической во время этой фазы развития личинок. Однако чтобы избежать случайного воздействия/инфекции улиток, ух…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Частично финансируется гранта NIH RO1AI015503. Schistosome инфицированных мышей были предоставлены NIAID шистосомоз ресурсный центр биомедицинских научно-исследовательском институте (Роквилл, MD) через низ-NIAID контракт HHSN272201000005I для распространения через BEI ресурсов.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
