Massa isolering och In Vitro -odling av Intramolluscan stadier av den mänskliga blod Fluke Schistosoma Mansoni
Summary
I artikeln beskrivs ett protokoll för storskalig axenic isolering och samling av frisimmande miracidia av mänskligt blod fluke Schistosoma mansoni och deras efterföljande behandling för införsel i vitro kultur.
Abstract
Människans blod VALSTJÄRT, Schistosoma spp., har en komplicerad livscykel som innebär sexuell och asexuell utvecklingsfaser inom en snigel mellanliggande och däggdjur slutliga-värd som, respektive. Möjligheten att isolera och upprätthålla de olika livscykelstadier villkor i vitro kultur har underlättat utredningar av de cellulära, biokemiska och molekylära mekanismer som reglerar parasit tillväxt, utveckling och värd interaktioner. Överföring av snäckfeber kräver asexuell reproduktion och utveckling av flera larval arrangerar inom snigel värden; från den smittsamma miracidium, genom primär och sekundär sporocysts, till den sista cercarial etappen som är infekterat människor. I denna uppsats presenterar vi ett stegvisa protokoll för massa kläckning och isolering av Schistosoma mansoni miracidia från ägg erhållits från lever av infekterade möss och deras efterföljande införsel i vitro kultur. Det förväntas att de detaljerade protokollet kommer att uppmuntra nya forskare att engagera sig i och bredda detta viktiga område av schistosome forskning.
Introduction
Mänskligt blod VALSTJÄRT Schistosoma spp., är smittämnen snäckfeber, en försummade tropiska sjukdomar som drabbar en uppskattade 230 miljoner människor världen över1. Den mest utbredda arten, Schistosoma mansoni, är geografiskt fördelade i Sydamerika, den Karibiska övärlden, Mellanöstern och subsahariska Afrika2. Livscykeln för S. mansonioch andra schistosomes, är komplex, som inbegriper en däggdjur slutgiltig värd och sötvatten sniglar i släktet Biomphalaria som fungerar som obligat mellanliggande värdar.
S. mansoni manliga och kvinnliga vuxen mask par lever i de däggdjur värd reproducera, bakre mesenteriska vener resulterar i utsläpp av embryonated ägg (ova) som fastna i de små venoler av tarmslemhinnan. Ägg sedan bryter genom kärlväggen, vandrar genom slemhinnor vävnad, och så småningom ange intestinala lumen där de annulleras med avföring. När ägg in sötvatten och frisimmande yngel (miracidia) hatch, måste, de på kort tid, hitta en lämplig Biomphalaria snigel att infektera för att fortsätta sin livscykel. Infektion innebär miracidial fastsättning snigelns yttre karossyta följt av aktiv penetration och inträde för larven i värden. Snart efter posten börjar miracidium att kasta sina yttre cilierade epidermal plattor eftersom det utgör ett syncytium som kommer att bli den nästa larvstadium, den primära eller mor sporocyst nya yttre yta (tegument). Genom asexuell reproduktion, varje primär sporocyst producerar och släpper en andra generation av sporocysts, kallas sekundär eller dotter sporocysts, som i sin tur genererar och frigöra stora mängder intramolluscan slutskedet, cercaria3 . Vid fly från snigel värden är frisimmande cercariae kan ansluta till och tränga direkt in i huden på en människa eller annan lämplig däggdjur värd. Vid inresa till sin nya värd, cercariae förvandla till parasitiska schistosomula scenen och invadera det vaskulära systemet. De, flyttar i sin tur till lungan och sedan till nedsatt ven där de mogna till vuxna maskar, bildar manliga och kvinnliga par och resa till mesenteriska vener att slutföra sin livscykel.
Lyckade intramolluscan eller ”snigel fas” utveckling av larval schistosomes är avgörande för fortsättningen av cykeln av mänsklig värd-till-värd överföring. Av avgörande betydelse är perioden följande post av de frisimmande miracidium snigel värden och sin tidiga omvandling till primära sporocyst scenen. Beroende på den fysiologiska och immunologiska kompatibiliteten mellan värd och parasit är det under denna fas av larval utveckling det inledande framgång eller misslyckande att fastställa infektioner är beslutsam4,5,6 . Framtida utveckling av primär sporocysts kan producera asexuellt sekundära sporocysts, som sedan generera mänskliga-smittsam cercariae, kräver ytterligare en tillåtande fysiologiska värd miljö som tillhandahåller för alla parasitens tillväxt och reproduktiva behov.
Hittills har lite är känt om den underliggande fysiologiska, biokemiska och molekylära processer som styr schistosome-snigel interaktioner, särskilt de molekyler och vägar involverade i reglerar larval utveckling och reproduktion, eller modulerande värd immunsvar. Tillgång till stort antal dessa larval arrangerar i vitro kultur villkor som tillåter experimentella manipulation skulle avsevärt underlätta upptäckten av utvecklingstoxicitet vägar och bakomliggande mekanismer för celltillväxt, differentiering och reproduktion. Kritiska parasit vägar eller mekanismer, identifierade genom in vitro- försök, kunde sedan användas för att störa larval tillväxt/reproduktion i snigel värden, eller att identifiera snigel värd immunologiska mekanismer involverade i erkännande och eliminering av miracidial eller sporocyst steg.
I denna artikel och videopresentation, vi ger en detaljerad beskrivning av en metod för att isolera ett stort antal frisimmande S. mansoni miracidia för införsel i vitro kultur som sedan kan bli föremål för uppföljning experimentella manipulation (se figur 1 för en schematisk översikt över arbetsflödet protokoll). Även om liknande förfaranden har beskrivits tidigare7,8,9, vi kände att ett detaljerat protokoll skulle vara användbar för forskare som vill anställa denna modell att ta fortfarande obesvarade frågor relaterade till intramolluscan larver utveckling, cellulär proliferation och schistosome-snigel immun interaktioner. Detta tillvägagångssätt kan dessutom enkelt anpassas för isolering av ägg från andra medicinskt viktiga sugmaskar såsom urinblåsan-bostad S. haematobium, levern VALSTJÄRT eller lung VALSTJÄRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia av S. mansoni, isolerade och manipulerade som beskrivs häri, kan infektera endast snigel mellanliggande värden, och därför utgör inte ett mänskligt biologiskt under denna fas av larval utveckling. Men för att undvika oavsiktlig exponering/infektion av sniglar, bör vara försiktig att utföra miracidial isoleringar på en annan plats från områden där mottagliga Biomphalaria snigel arter kan vara närvarande eller underhållas. Ett separat rum, registrerad som BSL2 utrymme, rekommende…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Delvis finansierad av NIH grant RO1AI015503. Schistosome-infekterade möss tillhandahölls av NIAID snäckfeber Resource Center vid biomedicinsk Research Institute (Rockville, MD) genom NIH-NIAID kontrakt HHSN272201000005I för distribution via BEI resurser.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
References
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
