Fagocytosanalys för apoptotiska celler i<em> Drosophila</em> Embryon

Summary

Här beskrivs en fagocytosanalys med användning av de dispergerade embryonala cellerna i Drosophila . Det gör att vi enkelt och exakt kan kvantifiera fagocytosnivåer in vivo och att identifiera nya molekyler som krävs för fagocytos av apoptotiska celler.

Abstract

De molekylära mekanismerna som ligger bakom fagocytos av apoptotiska celler behöver belysas mer i detalj på grund av dess roll i immun- och inflammatoriska ojämna sjukdomar. Här har vi utvecklat en experimentell metod för att undersöka fagocytos kvantitativt med hjälp av fruktflugan Drosophila , där genenätverket som styr engulferingsreaktioner är evolutionellt konserverade från däggdjur. För att noggrant detektera och räkna engulfing och un-engulfing fagocyter med hela djur homogeniserades Drosophila embryon för att erhålla dispergerade celler innefattande fagocyter och apoptotiska celler. Användningen av dispergerade embryonala celler gör det möjligt för oss att mäta in vivo fagocytosnivåer som om vi utförde en in vitro fagocytosanalys där det är möjligt att observera alla fagocyter och apoptotiska celler i hela embryon och exakt kvantifiera nivån av fagocytos. Vi bekräftade att den här metoden återger de tidigare studiernaSom identifierade de gener som erfordras för fagocytos av apoptotiska celler. Denna metod medger att engulfering av döda celler kan analyseras och när de kombineras med den kraftfulla genetiken hos Drosophila kommer att avslöja de komplexa fagocytiska reaktionerna som innefattas av migrering, igenkänning, engulfering och nedbrytning av apoptotiska celler av fagocyter.

Introduction

I metazoiska djur, t.ex. nematoden Caenorhabditis elegans , fruktflugan Drosophila melanogaster och möss och människor, genomgår ett stort antal celler apoptos under utveckling för att forma sina kroppar och i vuxenlivet för att upprätthålla homeostas ^{1 , 2} . Apoptotiska celler måste avlägsnas snabbt eftersom de inducerar inflammation i de omgivande vävnaderna genom att frigöra immunogena intracellulära material om de inte helt avlägsnas ³ . För att underlätta snabbt avlägsnande presenterar apoptotiska celler så kallade ägg-mig-signaler som kännetecknas av engulferingsreceptorerna av fagocyter och elimineras av fagocytos ^{3 , 4 , 5 , 6} . Fagocytos spelar således en avgörande roll för upprätthållandet av värdhomeostas och därmed belyser molekylen Lar mekanismer som ligger bakom fagocytos av apoptotiska celler är av betydelse.

Mekanismerna som är ansvariga för fagocytos av apoptotiska celler verkar vara bevarade evolutionärt bland arter i nematoderna, flugorna och mössen ⁷ . Flera fagocytosanalyser är för närvarande tillgängliga för att bedöma engulferingen av apoptotiska celler i dessa modelldjur. I C. elegans genomgår 131 somatiska celler programmerad celldöd under utveckling, och cellkroppar fagocyteras av närliggande celler, vilka är icke-professionella fagocyter ⁸ . Således räknar antalet återstående cellkroppar i C. elegans nivån av fagocytos in vivo . Genom att leta efter nematodmutanter som visar ett ökat antal döda celler har flera gener som krävs för fagocytos identifierats och genetiskt karakteriseras ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Ex vivo fagocytosanalyser med primära kultur fagocyter, vanligtvis makrofager, används ofta i möss. Apoptotiska celler framställs med användning av cellinjer, såsom Jurkat-celler, och blandas med primära fagocyter. Efter inkubation i flera timmar räknas det totala antalet fagocyter och engulfing fagocyter för att bedöma nivån av fagocytos. Som en sofistikerad modifiering av denna metod utvecklade Nagatas grupp en ex vivo fagocytosanalys med celler som uttrycker en caspasresistent ICAD (inhibitor av kaspasaktiverad DNas), i vilken apoptotiska celler inte genomgår apoptotisk DNA-fragmentering, men DNA klyvs fortfarande när Cellerna är fagocytoserade. När dessa celler används som apoptotiska mål i en fagocytosanalys, fragmenteras endast DNA från engulferade apoptotiska celler och färgas av TdT-medierad DUTP nickändmärkning (TUNEL). Därför lever de1 av apoptotisk cellupplösning mäts genom att räkna TUNEL-signaler i en blandning av fagocyter och apoptotiska celler ¹³ .

I D. melanogaster är professionella fagocyter benämnda hemocyter, Drosophila- makrofager, ansvariga för fagocytos av apoptotiska celler ^{14 , 15} . Förutom in vitro fagocytosanalyser med odlingscellinjer är in vivo fagocytosanalyser med hela Drosophila- embryon tillgängliga. Drosophila- embryon är ett kraftfullt verktyg för att undersöka nivån av apoptotisk cellintolerans eftersom många celler genomgår apoptos och fagocytoseras av hemocyter under embryonal utveckling ^{14 , 15 , 16} . Ett exempel på en in vivo fagocytosanalys är den metod som utvecklats av Francs grupp. I deras metod är hemocyter deTagen av immunostaining av peroxidasin, en hemocytmarkör, färgas apoptotiska celler med användning av kärnfärgämnet, 7-aminoaktinomycin D i hela Drosophila- embryon, och antalet dubbla positiva celler räknas som en signal av fagocytos ¹⁷ . Ett annat exempel på en fagocytosanalys på embryon baseras på begreppet Nagatas metod som beskrivits ovan; Emellertid utvärderas fagocytos in vivo med användning av embryonema av dCAD ( Drosophila caspase-aktiverad DNase) mutantflyger ^{18 , 19} . Dessa in vivo fagocytosanalyser är användbara för att direkt observera fagocytos in situ . Dock är svårigheter förenade med att utesluta eventuell förspänning i steget att räkna fagocytoseceller eftersom det är svårt att observera alla fagocyter och apoptotiska celler i hela embryon på grund av dess tjocklek.

För att övervinna denna begränsning utvecklar viUtarbetade en ny fagocytosanalys i Drosophila- embryon. I vår metod, för att enkelt räkna fagocytoserade hemocyter, homogeniseras hela embryon för att framställa dispergerade embryonala celler. Fagocyter detekteras genom immunfargning av en fagocytmarkör, och apoptotiska celler detekteras av TUNEL med dessa dispergerade embryonala celler. Användningen av dispergerade embryonala celler gör det möjligt för oss att mäta in vivo fagocytosnivåer som om vi utförde en in vitro fagocytosanalys som exakt kvantifierar nivån av fagocytos. Alla genotyper av flugor kan användas i denna analys om de utvecklas till stadium 16 av embryon ²⁰ , utvecklingsstadiet vid vilket apoptotiskt cellutrymme genom fagocytos är den mest omfattande. Denna metod har fördelen att man bedömer nivået av fagocytos kvantitativt och kan således bidra till identifieringen av nya molekyler som är involverade i fagocytos av apoptotiska celler in vivo .

Protocol

1. Framställning Framställning av färska druvsaftagarplattor Tillsätt 100 ml vatten till 4,4 g agar och värm blandningen i en mikrovågsugn för att lösa agar. Tillsätt 80 ml färsk druvsaft, 5 ml ättiksyra och 5 ml etanol till agarlösning. Häll ungefär 1,5 ml av lösningen med en pipett på varje glasskiva och låt den stelna. Framställning av 6 cm dish agarosplattor Tillsätt 50 ml vatten till 0,5 g agaro…

Representative Results

För att undersöka fagocytos av apoptotiska celler uppsamlades Drosophila- embryon från utvecklingsstadiet 16 och framställdes som dispergerade celler. Hemocyter, Drosophila makrofager, färgades genom immuncytokemi för hemocyte markör "Croquemort" 17, 22 med användning av en specifik antikropp 19, 21, och apoptotiska celler färgades gen…

Discussion

Här beskrivs en fagocytosanalys med användning av Drosophila- embryon. Genom att använda dispergerade embryonala celler för att mäta fagocytos kvantitativt immuniseras hemocyter, professionella fagocyter Drosophila , för hemocytmarkören Croquemort eller srpHemo- driven GFP, och apoptotiska celler detekteras av TUNEL i detta protokoll. Nivået av fagocytos uttrycks som ett fagocytiskt index genom att räkna det totala antalet hemocyter och fagocytoserade hemocyter. Användningen av…

Materials

whole swine serum	MP Biomedicals	55993	For bloking
Treff micro test tube(easy fit)  Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL	TreffLab	96. 4625. 9. 01	For  homogenization
pellet mixer  1.5 mL	TreffLab	96. 7339. 9. 03	For  homogenization
Collagenase	Sigma-Aldrich	C-0130	For preparation of embryonic cells
Trypsin	Thermo Fisher SCIENTIFIC	27250-018	For preparation of embryonic cells
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate	Roche	11383221001	BCIP, For staining of hemocytes
nitro blue tetrazolium	Roche	11383213001	NBT, For staining of hemocytes
Anti-Croquemort antibody			described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1)	Roche	11814460001	For staining of hemocytes
Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate	Bio-Rad	170-6520	secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody
Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100	For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride	nacalai tesque	11009-41	DAB, For staining of apoptoitc cells
Table of Fly Strains
Name	Company	Catalog Number	Comments
w1118			Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580
drprΔ5			drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580
Itgbn2			Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415
srpHemoGAL4 UAS-EGFP			described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84
UAS-drpr-IR	VDRC	4833	–
UAS-Itgbn-IR	NIG-fly	1762R-1	–