विच्छेदन और राज्याभिषेक टुकड़ा माउस पिट्यूटरी ग्रंथि के विकास की तैयारी
Summary
हम टुकड़े पिट्यूटरी ग्रंथियों के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और चूहों के विकास से पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों को तैयार.
Abstract
पिट्यूटरी ग्रंथि या hypophysis एक महत्वपूर्ण अंत में स्रावी अंग स्रावी हार्मोन homeostasis के लिए आवश्यक है । यह अलग भ्रूण मूल और कार्यों के साथ दो ग्रंथियों के होते है-neurohypophysis और adenohypophysis । विकासशील माउस पिट्यूटरी ग्रंथि छोटे और नाजुक एक लंबी अंडाकार आकार के साथ है । एक राज्याभिषेक अनुभाग माउस पिट्यूटरी का एक टुकड़ा में दोनों adenohypophysis और neurohypophysis प्रदर्शित करने के लिए पसंद है.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य चूहों के विकास से अच्छी तरह से संरक्षित ऊतक वास्तुकला के साथ उचित पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से वर्णन कैसे टुकड़े और प्रक्रिया पिट्यूटरी ग्रंथियों ठीक से चूहों के विकास से । पहला, चूहों विच्छेदन करने से पहले formaldehyde के transcardial छिड़काव द्वारा तय कर रहे हैं. तो फिर तीन अलग विदारक तकनीक चूहों की उम्र के आधार पर बरकरार पिट्यूटरी ग्रंथियों को प्राप्त करने के लिए लागू कर रहे हैं. भ्रूण के लिए चूहों आयु वर्ग के भ्रूण (ई) १७.५-१८.५ और नवजात अप करने के लिए 4 दिन, फन्नी हड्डी, ग्रंथि, और, सेलला सहित संपूर्ण क्षेत्रों में विच्छेदित कर रहे हैं । प्रसव दिन आयु वर्ग के पिल्ले के लिए (पी) 5-14, पिट्यूटरी नसों के साथ जुड़े हुए एक समग्र रूप से कीट ग्रंथियों. 3 सप्ताह से अधिक पुराने चूहों के लिए, पिट्यूटरी ग्रंथियों ध्यान से आसपास के ऊतकों से मुक्त विच्छेदित कर रहे हैं. हम यह भी प्रदर्शित कैसे एक उचित अभिविंयास में पिट्यूटरी ग्रंथियों के लिए स्थलों के रूप में आसपास के ऊतकों का उपयोग करके संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए एंबेड । इन पद्धतियों चूहों के विकास में पिट्यूटरी ग्रंथियों के ऊतकीय और विकासात्मक सुविधाओं का विश्लेषण करने में उपयोगी होते हैं ।
Introduction
पिट्यूटरी ग्रंथि या hypophysis एक महत्वपूर्ण अंत में स्रावी अंग स्रावी हार्मोन homeostasis1,2के लिए आवश्यक है । शारीरिक, पिट्यूटरी ग्रंथि एक ‘ ‘ दो में एक ‘ ‘ संरचना neurohypophysis और adenohypophysis से मिलकर है । इन भागों अलग भ्रूण मूल और समारोह बहुत अलग है । neurohypophysis तंत्रिका बाह्यत्वक और स्राव ऑक्सीटोसिन और एन्टिडाययूरेटिक हार्मोन से प्राप्त होता है । adenohypophysis Rathke की थैली से शुरू होता है और वृद्धि हार्मोन, प्रोलैक्टिन, थायराइड उत्तेजक हार्मोन, कूप उत्तेजक हार्मोन, luteinizing हार्मोन, adrenocorticotropic हार्मोन सहित हार्मोन की रिहाई के लिए जिंमेदार है, और melanocyte-उत्तेजक हार्मोन3,4,5.
पिट्यूटरी ग्रंथि माउस खोपड़ी के फन्नी अस्थि (सेलला turcica) की पृष्ठीय सतह पर टिकी होती है और एक नाजुक डंठल द्वारा मस्तिष्क की मंजिल से जुड़ी होती है. यह बाद में,6,7ऑप्टिक chiasm द्वारा, और पूर्वकाल में है । ग्रंथि अपनी लंबी धुरी सिर की है कि सीधा के साथ एक लंबी अंडाकार आकार है । इसके पृष्ठीय सतह पर, neurohypophysis और adenohypophysis आसानी से demarcated जा सकता है, पूर्व पृष्ठीय औसत दर्जे का क्षेत्र पर कब्जा और बाद में विस्तार और ventrally के बाद । प्रसव विकास के दौरान, पिट्यूटरी के आकार में तेजी से बढ़ जाती है जन्म के बाद पहले महीने में8,9. फिर भी, माउस पिट्यूटरी अभी भी एक औसत वजन के साथ आकार में बहुत छोटा है १.९ मिलीग्राम और एक लंबे समय के अक्ष व्यास ~ में 3 मिमी के वयस्क10, एक लंबी अक्ष व्यास 2-२.५ मिमी पर प्रसव दिन 21 (P21), और केवल 1-१.५ मिमी पर P0.
एक राज्याभिषेक अनुभाग माउस पिट्यूटरी का एक टुकड़ा में दोनों adenohypophysis और neurohypophysis प्रदर्शित करने के लिए पसंद है. हालांकि, कुछ तकनीकी कौशल अपने असाधारण छोटे आकार और अलग शरीर रचना विज्ञान के कारण चूहों विकसित करने से पिट्यूटरी ग्रंथियों की संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । इस वीडियो लेख में, हम प्रदर्शन कैसे माउस पिट्यूटरी ग्रंथियों टुकड़े करने के लिए और विभिंन विकास के चरणों में पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों तैयार करते हैं ।
Protocol
C57BL/6 चूहों विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों में पैदा कर रहे हैं । सभी पशु प्रायोगिक तरीके दूसरी सैंय चिकित्सा विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और नीतिशास्त्र समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुपा…
Representative Results
Discussion
murine pituitaries के विकास के लिए, यह तकनीकी रूप से उनके छोटे और नाजुक सुविधाओं और अद्वितीय शारीरिक विशेषताओं6,8के कारण उचित राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है । कुछ ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (३१२०१०८६, ३१४७०७५९ और ३१६७१२१९) और शंघाई नेचुरल साइंस फाउंडेशन (12ZR1436900) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
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