Disseksjon og koronale del forberedelse for å utvikle musen hypofysen
Summary
Vi presenterer en protokoll for å analysere hypofysen kjertler og forberede hypofysen framskaffet fra utviklingsland mus.
Abstract
Hypofyse eller hypofysen er en viktig endokrine organ sekresjon hormoner avgjørende for homeostase. Det består av to kjertler separat embryonale opprinnelse og funksjoner-neurohypophysis og adenohypophysis. Utvikle musen hypofysen er liten og delikat med en langstrakt oval form. En koronale delen er foretrukket å vise både adenohypophysis og neurohypophysis i et enkelt stykke musen hypofysen.
Målet med denne protokollen er å oppnå riktig hypofysen framskaffet med velbevarte vev arkitekturer fra utviklingsland mus. I denne protokollen beskrive vi i detalj hvordan å dissekere og behandle hypofysen kjertler riktig fra utviklingsland mus. Først repareres mus av transcardial perfusjon av formaldehyd før disseksjon. Tre ulike dissecting teknikker brukes deretter for å få intakt hypofysen kjertler avhengig av alderen på mus. For fosterets mus alderen embryonale dager (E) 17,5-18,5 og nyfødte opp til 4 dager, er hele sella områdene inkludert sphenoid bein, kjertel og trigeminal nerve dissekert. For pups er alderen postnatal dager (P) 5-14, hypofysen kjertler knyttet trigeminal nerve dissekert som helhet. For mus over 3 uker gamle, er hypofysen kjertler omhyggelig dissekert gratis fra omkringliggende vev. Vi viser også hvordan å bygge hypofysen kjertler i en riktig retning ved hjelp av omkringliggende vev som landemerker for å oppnå tilfredsstillende framskaffet. Disse metodene er nyttige i å analysere histologiske og utviklingsmessige funksjoner i hypofysen kjertler utvikle mus.
Introduction
Hypofyse eller hypofysen er en viktig endokrine organ sekresjon hormoner nødvendig for homeostase1,2. Anatomisk, er hypofysen en ” to-i-ett ” struktur bestående av neurohypophysis og adenohypophysis. Disse delene har forskjellige embryonale opprinnelse og funksjonen veldig annerledes. Neurohypophysis er avledet fra den nevrale ektoderm og utskiller oksytosin og antidiuretic hormon. Adenohypophysis kommer fra Rathkes pose og er ansvarlig for utgivelsen av hormoner, inkludert veksthormon, prolaktin, skjoldbrusk – stimulerende hormone, follicle – stimulerende hormone, luteiniserende hormon, adrenocorticotropic hormon, og melanocyte – stimulerende hormone3,4,5.
Hypofysen hviler på dorsal overflaten av sphenoid benet (sella turcica) av musen skallen, og er festet til gulvet i hjernen av en skjør stilk. Det ligger lateralt ved trigeminal nerve og peke optikk chiasm6,7. Kjertel har en langstrakt oval form med sin lange akse vinkelrett med hodet. På dorsal overflaten, kan neurohypophysis og adenohypophysis lett bli grenser, med tidligere opptar dorsal mediale regionen og den sistnevnte utvide lateralt og ventrally. Under postnatal utvikling øker størrelsen på hypofysen raskt i den første måneden etter fødselen8,9. Likevel er musen hypofysen fortsatt svært små i størrelse med en gjennomsnittlig vekt på 1,9 mg og lang-aksen diameter på ~ 3 mm voksen10, lang-aksen diameter 2-2.5 mm på postnatal dag 21 (P21) og bare 1-1,5 mm på P0.
En koronale delen er foretrukket å vise både adenohypophysis og neurohypophysis i et enkelt stykke musen hypofysen. Noen tekniske ferdigheter kreves imidlertid å oppnå tilfredsstillende framskaffet hypofysen kjertler fra utviklingsland mus på grunn av den usedvanlig lille størrelsen og distinkte anatomi. I denne videoen artikkelen viser vi hvordan å dissekere musen hypofysen kjertler og forberede hypofysen framskaffet på ulike stadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvikle murine pituitaries, har det vært teknisk vanskelig å få riktig framskaffet sine små og skjøre og unike Anatomiske egenskaper6,8. Noen forskningsgrupper derfor valgte midt-sagittal deler analysere morfologi av embryonale og neonatal hypofysen11,12. Skjønt den midt-sagittal delen av hypofysen er likeledes dugelig av viser fremre, middels og bakre fliker i et enkelt stykke, den koronale delen e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31201086, 31470759 og 31671219) og Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
