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Neurosciences

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。

Abstract

Gaba 作動性皮質介在ニューロンは、興奮性錐体細胞の出力を調節するだけでなく、アンサンブル錐体細胞の出力を同期で重要な役割を果たす細胞の異種集団です。介在ニューロン機能の欠損は、さまざまな統合失調症、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患に関与しています。胚性幹細胞から皮質介在ニューロンの導出は、彼らの開発と機能の研究では、だけでなく、皮質介在関連疾患の発症分子メカニズムに洞察力を提供します。介在ニューロンはまた生き残るため、移行、および統合ホスト皮質回路移植後、細胞ベースの治療で使用するための理想的な候補者を作る顕著な能力を持っています。Nkx2.1 を表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫なマウス胚性幹細胞 (mESCs) からの派生にスケーラブルな非常に効率的な変更された胚様体-単層メソッドを紹介します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインを使用して、Nkx2.1 前駆細胞または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを介して分離でき後でダウン ストリーム アプリケーションの数で使用します。我々 はまた運命決定の側面を研究するため、または使用するためサブグループ濃縮介在から寄与する治療への応用に役立つ可能性があります (SST) 介在のサブグループ、パルブアルブミン (PV) またはソマトスタチンの豊かにするメソッドを提供します。移植。

Introduction

マウスとヒトの両方でほぼすべて皮質抑制性介在ニューロン (CIns) の半分で内側の神経節隆起 (MGE) として知られている一時的な皮質下構造内で発信 CIns 他神経細胞とグリア細胞の上皮細胞内前駆細胞サブグループは、転写因子 Nkx2.11,2を表現します。CIn サブグループまたはサブタイプは、形態学的、神経化学的、電気生理学的の交差と接続特性3,4によって定義されます。MGE 派生 CIns に分けられます太陽光発電または SST、電気生理学的および接続の特定の傾向5どの相関式の表現に基づいて主に非重複のサブグループ。特に PV サブグループ、介在神経の機能不全は、複数神経疾患と疾患6,7に関与しています。このメソッドの全体的な目標は、幹細胞由来細胞分裂前駆細胞と太陽光発電または SST CIn の運命: 皮質介在ニューロンの生物学を勉強するため、細胞ベースの治療で使用するための濃縮渡り鳥の前駆体を生成することです。

Nkx2.1 表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫な mESCs からの派生のためのスケーラブルな非常に効率的な手法を提案します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP を使用してデュアル レポーター mESC 行8、Nkx2.1 前駆細胞、または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫を FACS による分離し後で多くのダウン ストリーム アプリケーションで使用できます。シグナル伝達経路の数、文化の期間、神経新生のモードを操作することによって数百万の蛍光に分類された介在ニューロン前駆体下流のアプリケーション ホストに適してを取得できます。

MESCs9,10、11,12,13,14, Wnt に依存している私たちのメソッドから MGE のような前駆細胞を生成するためにいくつかの他の方法が存在するが価格 939、拮抗薬は、Foxg1/Nkx2.1 胎生前駆細胞の共発現を生成するに特に効果的です。さらに、介在ニューロン前駆細胞や、デュアル レポーター システムを介して彼らポスト mitotic Lhx6 表現の子孫を選択する能力は大きく異なる前駆細胞および彼らの子孫を生成する能力を高めます。

Protocol

注: このプロトコルで記述されているデュアル レポーター mESC ラインはリクエスト制 (sande@mail.med.upenn.edu です)。 1. メディアの準備 注: は、細胞培養で使用する前に 37 ° C にすべてのメディアを温めます。 (500 mL の準備) のマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) メディア ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と 500 mL 0.22 μ m 孔フィ?…

Representative Results

このペーパーで説明したプロトコルの公開プロトコル15,16,17の修正版で、私たち Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインでの使用に最適化されています。DD0 ~ 5 DD8、再メッキと組み合わせる価格 939 wnt シグナル阻害剤を追加することにより前記の文化のすべての DAPI + 核の 50% 以上も Nkx2….

Discussion

この方法は J1 から派生した mESCs (SCRC-1010) をパターンで非常に効果的な他 mESC 回線とクローン分離変数の成功を経験した.たとえば、Foxg1::venus mESCs (EB3 派生;男女ら13) 応答このプロトコルと DD12 Foxg1 誘導が不十分な通常 1-2% 程度です。理由は我々 は完全に理解していないが、(JQ27 と呼ばれる) この議定書に記載されている行と同時に分離された (JQ59 と呼ばれる) もう一?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロトコルを開発することの彼らの初期の作品の Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP デュアル レポーター mESC ライン ジェニファー タイソン、アシフ Maroof、ティム ・ ペトロスを開発するため清徐に感謝しております。また、テクニカル サポートにチョップ流れ cytometry コアを感謝いたします。この作品は、NIH R01 MH066912 (SA) と F30 MH105045 02 (DT) によって支えられました。

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
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References

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Keywords: Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies
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Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
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