Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Résumé

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont susceptibles de faire la différence dans l’une des trois couches germinales (endoderme, mésoderme et ectoderme) et peuvent générer de nombreux lignages pour la médecine régénérative. ES cellules la culture in vitro est depuis longtemps l’objet de préoccupations répandues. Classiquement, les souris ES cellules sont maintenues en facteur inhibiteur sérique et la leucémie (LIF)-contenant le support. Toutefois, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, cellules montrent l’hétérogénéité dans la morphologie et le profil d’expression des gènes reliés à la pluripotence et sont pour la plupart dans un état métastable. En outre, des cellules ES pièce hyperméthylation globale, mais cellules ES naïve de la masse cellulaire interne (MCI) et les cellules germinales primordiales (PGC) sont dans un état de l’hypométhylation globale. L’État hypométhylés de l’ICM et PGC est étroitement associé à leur pluripotence. Pour améliorer les méthodes de culture cellulaire souris ES, nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode basée sur l’utilisation sélective combinée des deux composés de petites molécules pour maintenir l’état de hypométhylés et pluripotentes d’ADN. Ici, nous présentons qui le co-traitement de vitamine C (Vc) et PD0325901 permet d’effacer environ 90 % de la 5-méthylcytosine (5mC) à 5 jours dans les cellules ES de souris. Le contenu généré 5mC est comparable à celui dans le PGC. L’enquête mécaniste montre que PD0325901 up-régule l’expression Prdm14 pour supprimer Dnmt3b (de novo ADN méthyltransférase) et Dnmt3l (le cofacteur de Dnmt3b), en réduisant la synthèse de novo de 5mC. VC facilite la conversion de 5mC à 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) catalysée principalement par Tet1 et Tet2, en indiquant l’implication des demethylations ADN passives et actives. Par ailleurs, dans des conditions de Vc/PD0325901, cellules ES souris montrent morphologie homogène et état pluripotent. Collectivement, nous vous proposons un procédé nouveau et culture chimique-synergie pour atteindre l’hypométhylation de l’ADN et l’entretien de la pluripotence des cellules de souris ES. La méthode chimique dépendant de petites molécules permet de surmonter les lacunes importantes de la culture de sérum et promesse de cales pour générer des cellules ES homogènes pour davantage les applications cliniques et de recherches.

Introduction

CSEh est provenus de l’ICM un blastocyste¹. Les cellules sont dans un état de pluripotence et peuvent former tous les lignages somatiques et de cellules germinales². Mise en place de cellules d’ES fournit l’occasion d’étudier le développement des processus in vitro et peut générer des cellules médicales présentant un intérêt pour la médecine régénérative basée sur leur pluripotence³.

Deux groupes seminally établi les lignées de cellules de souris ES en 1981 et quand a cultivé des cellules dérivées de l’embryon précoce de souris en sérum fœtal (SVF)-contenant le....

Protocole

1. les préparatifs

1. Préparer une solution de 1,0 mM PD0325901 (inhibiteur de la MEK) et 3,0 mM CHIR99021 (inhibiteur de GSK3).
   1. Peser 2 mg de PD0325901 et ajouter 4,15 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré.
   2. Peser 2 mg de CHIR99021 et ajouter 1,43 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré.
   3. Suivante reconstitution, stocker aliquotes (50 µL/tube en tube PCR 200 µL) à-20 ° C et l’abri de la lumière. Retirer un tube contenant le stock congelé d’une congélation et décongélation à température ambiante avant utilisation.
2. Peser 0,0176 g du CR dans 1 mL d’un tube à centrifuger et reconstituer ave....

Résultats

VC/PD0325901 induite en synergie l’effacement global de cellules ES de souris. Dans le sérum, les cellules de souris ES pièce hyperméthylation de l’ADN, tandis que les cellules pluripotentes ICM et PGC montrent l’effacement global de la méthylation de l’ADN et de l’État hypométhylés est étroitement lié à leur pluripotence^9,10.

Auparavant, nous et autres découvrirent que .......

Discussion

Dans le travail, nous avons démontré une méthode originale de combiner Vc et PD0325901 afin de soutenir des cellules de souris ES à un État indifférencié et hypométhylés, qui a été réalisé par une action synergique favorisant la déméthylation de l’ADN par CR et la suppression de novo de l’ADN méthylation de PD0325901. En outre, souris ES cellules montrent morphologie grande sous le système de culture Vc/PD0325901.

Afin de mieux soutenir l’état de cellules de souris ES dans le système .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
sérum fœtal bovin Australie source	Corning	35-076-CV	Composant du milieu cellulaire ES de souris
DMEM/hyperglucose	Hyclone	SH30022	Composant du milieu cellulaire ES de souris
LIF	Millipore	ESG1107	Composant du milieu cellulaire ES
de souris Acides aminés non essentiels (NEAA)	Gibco	11140050	Composant du milieu
pyruvate de sodium	Gibco	11360070	Composant du milieu cellulaire ES de souris
L-glutamine	Gibco 25030081		Composant du milieu cellulaire ES de souris
solution de pénicilline streptomycine	Gibco	15140122	Composant du milieu cellulaire ES de souris
PBS	Sigma	P5493	Rinçage des cellules
trypsine	Hyclone	SH30042	Dissociation cellulaire
gélatine	Sigma	48722	Revêtement de vaisselle
PD0325901	Stemolecule	04-0006-10	produit chimique à petites molécules pour la culture cellulaire
CHIR99021	Stemolecule	04-0004	produit chimique à petites molécules pour la culture cellulaire
vitamine C	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd  ;	XW00508171	produit chimique à petites molécules pour la culture cellulaire
Système de purification d’eau Ultra Bioscience	Purelab	Ultra	Ultra eau
DMSO	Sigma	D8418	Centrifugeuse de milieu de congélation cellulaire
	Eppendorf	5427R	Extraction d’ADN et de protéines
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma	P8340	Composant du tampon
PMSF Inhibiteur de protéase	ThermoFisher Scientific	36978	Composant du tampon RIPA
DTT	Sigma	43815	Composant du tampon RIPA
EGTA	Sigma	E3889	Composant du tampon RIPA Kit de
purification de l’ADN génomique  ;	Promega	A1125	Extraction génomique de l’ADN
NanoDrop 2000	ThermoFisher Scientific	NanoDrop 2000	Détermination de la concentration d’ADN
phosphatase intestinale de veau	New England Biolabs	M0290	Digestion de l’ADN
DNase I	New England Biolabs	M0303	Digestion de l’ADN
phosphodiestérase du venin de serpent I	Sigma	P4506	Digestion de l’ADN
Nanosep 3K Omega	Pall	OD003C35	filtration de l’ADN digéré
1290 Système UHPLC	Agilent  ;	1290	Spectromètre
masse triple quadripôle de séparation UHPLC G6410B	Agilent  ;	G6410B	Analyse MS/MS
Zorbax Eclipse Plus C18 colonne	Agilent  ;	Colonne Zorbax Eclipse Plus	pour la séparation UHPLC
5-méthylcytosine	Solarbio Life Sciences	SM8900  ;	standard 5mC
5-hydroxyméthylcytosine (standard)	Toronto Research Chemicals	M295900	norme 5hmC
Prdm14 anticorps	bioworld	BS7634	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody	bioworld	BS6587	Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody	abcam	ab13604	Western blot analysis-primary antibody
Anticorps Dnmt3l	abcam	ab3493	Analyse par transfert Western-anticorps primaire
Anticorps Dnmt1	abcam	ab13537	Analyse par transfert Western-anticorps primaire
&bêta ;-tubuline anticorps	bioworld	BS1482MH	Analyse par transfert Western-anticorps primaire
chèvre anti-lapin IgG	abcam	ab6721	Analyse par transfert Western-anticorps secondaire
chèvre anti-souris	IgG abcam	ab6789	Western blot analysis-anticorps secondaire
Trizol	Invitrogen	15596-026	Extraction d’ARN
système de transcription inverse	Promega	A3500	Transcription inverse de l’ARN
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001	RT-PCR
StemTAG kit de coloration et d’activité de la phosphatase alcaline	Cellules Biolabs, Inc.	CBA-302	; analyse de la coloration à la phosphatase alcaline souris
cellules ES : WT, 129 SvEv	Fourni par le professeur Guoliang Xu (Instituts de Shanghai pour les sciences biologiques, Académie chinoise des sciences, Shanghai, Chine)		souche cellulaire de souris ES
cellules microscope	Zeiss	LSM510	observation
des cellules GraphPad Prism 5.0	GraphPad Prism Software Inc.	5.0	Analyse statistique

cellulaire ES de sourisRIPA de