MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법
Summary
우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.
Abstract
배아 줄기 (ES) 세포 (endoderm, mesoderm, 또는 ectoderm), 3 개의 세균 층의 구분을 하 고 재생 의학에 대 한 많은 계보를 생성할 수 있습니다. ES 세포 문화에서 체 외에 는 오랫동안 광범위 한 관심사의 주제. 마우스 ES 세포 혈 청 및 백혈병 금지 요인 (LIF)에서 유지 관리 하는 고전적인,-포함 하는 매체. 그러나, 혈 청/LIF 조건 하에서 세포 형태학 및 pluripotency 관련 유전자의 식 프로 파일에서이 표시 하 고 준 상태에서 주로. 또한, 교양된 ES 세포 전시 글로벌 hypermethylation 하지만 순진한 ES 세포는 안 세포 질량 (ICM) 및 원시 생식 세포 (PGCs)의 글로벌 hypomethylation의 상태에 있습니다. ICM과 PGCs의 hypomethylated 상태 그들의 pluripotency와 밀접 하 게 연결 됩니다. 마우스 ES 세포 문화 방법 개선, 최근 DNA hypomethylated 만능 상태를 유지 하기 위해 두 개의 작은 분자 화합물의 선택적으로 결합 된 사용률을 기반 하는 새로운 방법을 개발 했습니다. 여기, 우리는 비타민 C (Vc)의 공동 치료를 제시 하 고 PD0325901 마우스 ES 세포에서 5 일에 5-methylcytosine (5mC)의 약 90%를 지울 수 있습니다. 생성 된 5mC 콘텐츠는 PGCs에 비교. 기계 조사 보여준다는 PD0325901 최대-조절 억제 Dnmt3b Prdm14 식 (de novo DNA methyltransferase) 및 Dnmt3l (Dnmt3b의 공동 인자), 드 노 보 5mC 합성을 감소 시켜. Vc는 모두 수동 및 활성 DNA demethylations의 참여를 나타내는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) Tet1 및 Tet2에 의해 주로 촉매 변환 용이. 또한, Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포 균질 형태학 및 만능 상태를 표시합니다. 샨 다, 우리 소설과 화학 시너지 문화 DNA hypomethylation 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수를 달성 하기 위한 방법을 제안 합니다. 작은 분자 화학 종속 메서드 혈 청 문화, 그리고 균질 ES 세포 연구에 대 한 추가 임상 응용 프로그램 생성을 보유 약속의 주요 단점을 극복 했다.
Introduction
ES 세포 blastocyst1의 ICM에서 기인 된다. 셀은 pluripotency 상태에 있고 모든 계보 체세포와 생식 세포2형성할 수 있다. ES 세포의 설립 기회 개발 조사를 생체 외에서 처리 하 고 그들의 pluripotency3에 기반 하는 재생 의학에 대 한 의료 관련의 세포를 생성할 수 있습니다 제공 합니다.
두 그룹은 seminally 1981 년에 마우스 ES 세포 라인을 설립 하 고 소 태아 혈 청 (FBS)에 셀 초기 마우스 배아에서 파생 했다 경작 하는 때-급지대 레이어1,4로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)와 매체를 포함 하 . MEFs mitotically 비활성화 했다 고 미리 이전에 ES 세포를 배양 접시에 성장 했다. MEFs는 마우스 ES 셀 첨부 파일에 대 한 지원을 제공 하 고 전파를 홍보 하 여 필수적인 영양 요소와 세포 증식에 대 한 호르몬을 제공 하는 FBS 차별화5억 누르다 성장 인자를 생산. 후속 연구 LIF 피더 세포에 의해 생성 했다 자기 갱신 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수에 대 한 주요 cytokine 매체에 LIF의 추가 피더 세포6에 대 한 대체할 수 있는 표시. 현재, 지류에 FBS/LIF 매체에 마우스 ES 세포의 주 아직도 많은 연구자에 의해 채택 된 표준 방법입니다. 그러나,이 고아 한 문화 접근 몇 가지 문제가 발생합니다. 첫째, 피더 세포 분 비 과잉 통제 요인 및 병원 성 오염7을 발생할 수 있습니다. 혈 청에 포함 된 젤라틴과 요리 표면 및 LIF의 추가 코팅이 간섭을 유발 하지 않도록 매체 급지대 계층 셀 없이 마우스 ES 세포를 유지 하기 위한 대체 방법이 있습니다. 또한, 혈 청/LIF 조건 하에서 성장 하는 마우스 ES 세포 형태학이 세포 인구 및 pluripotency 관련 요인8식 수준 에서도 전시. 최근 연구 제안 조건 하에서 혈 청/LIF, (를 포함 하 여, Nanog, OCT4, SOX2) pluripotency 관련 핵심 전사 인자 LIF 및 WNT 신호; 통해 pluripotency 유지할 수 있습니다. 그러나, 특히, 그들은 또한 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 신호 차별화8트리거를 활성화 합니다. 핵 녹음 방송 요인의 상반 된 이중 작용으로 인해 마우스 ES 세포 혈 청에서 교양된 ICM을 닮은 끝났다 epiblast 상태8다른 유사한 두 개의 상호 인구의 구성 된이 현재. 또한, 마우스 ES 세포 혈 청에 자주 전시 글로벌 hypermethylation9, ICM과 PGCs 그들의 pluripotency9,10와 밀접 하 게 연결 되는 글로벌 hypomethylated 상태에 있는 반면.
마우스 ES 세포 배양을 위한 새로운 방법을 개발 하는 상당한 수요가 있다. 여러 가지 향상 된 프로토콜 200311 이후 설립 되었습니다 하지만 몇 가지 제한 사항 및 단점7계속. 2008 년 이후, 두 개의 작은 분자 kinase 억제제, PD0325901의 결합된 이용 (물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK)의 억제 물 extracellular 신호 통제 / 키 니 아 제 (ERK) (MEK)) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase의 억제제를 키 니 아 제 3 (GSK3)), 자란 마우스 ES 세포12대 한 N2B27 에 매체 LIF와 혈 청 하지 않고 새로운 관점 오픈 했습니다. 이 새로운 정의 된 매체 2 억제제 (2i)의 사용에 의해 특징입니다. 2i/LIF 매체에 경작 마우스 ES 세포는 세포 인구 및 pluripotency 요인의 표현에 더 균질. 또한, 2i/LIF 교양 마우스 ES 세포 전시 DNA hypomethylation 세계적으로 ICM 같은 셀9,13에 가깝다. 그럼에도 불구 하 고, 2i 문화는 그것의 단점이 있습니다. PD0325901 및 CHIR99021는 물에 용 해 일반적으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 해산-문화 매체에 그들을 추가 하려면 재고 솔루션을 기반으로. 연구는 그 장기 그리고 DMSO에 셀의 낮은 복용량 노출 세포 독성14이어질 수 있습니다.
우리 두 작은 분자 화합물을 활용 하는 여기, 마우스 ES 세포의 새로운 문화 방법을 개발 하 고. 새로운 문화 메서드 빠르게 DNA hypomethylation 홍보 Vc와 MEK 억제제 PD0325901를 결합 하 고 효과적으로 PGC의 유사한 수준에 임명 된 Vc/PD0325901 자란 프로토콜. Vc/PD0325901 추가 혈 청에 포함 된 매체에 마우스 ES 세포 형태학에 동질성을 전시 하 고 접지 상태에서 지속. 2i 문화에 비해, Vc/PD0325901 조건 하에서 경작 하는 마우스 ES 세포 DNA demethylation의 빠른 활동을 전시 하 고 PGC의 비교 hypomethylation 수준에 도달할 수 있습니다. 또한, 단일 억제제 (PD0325901)를 사용 하 여 2에서 사용에 비해 중간에 DMSO의 입력된 금액 감소 (PD0325901/CHIR99021) 셀에 피해를 감소 시킨다.
Protocol
Representative Results
Discussion
작품, 우리 시연 Vc 및 PD0325901 vc DNA demethylation를 홍보 하 고 de novo DNA 억제 시너지 행동에 의해 달성 되었다는 undifferentiated 및 hypomethylated 상태에서 마우스 ES 세포를 유지 하기 위해 결합 하는 새로운 방법 메 틸 PD0325901입니다. 또한, 마우스 ES 세포 Vc/PD0325901 문화 시스템 아래 큰 형태를 보였다.
더 나은 마우스 ES 세포의 상태는 Vc/PD0325901 문화 시스템에서을 하려면 몇 가지…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국가 자연 과학 재단의 중국 (21435008 및 호우를 21327006), 그리고 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 (호우에 XDB14030200).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
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