Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.

Abstract

Studien auf dem Gebiet der Mikrobiologie verlassen sich auf die Umsetzung einer Vielzahl von Methoden. Insbesondere trägt die Entwicklung geeigneter Methoden wesentlich zur bietet umfangreiche Kenntnisse des Stoffwechsels von Mikroorganismen in chemisch definierten Medien mit einzigartigen Stickstoff und Kohlenstoffquellen wachsen. Im Gegensatz dazu bleibt die Verwaltung durch den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen, trotz ihrer breite Präsenz in natürlichen oder industriellen Bereichen nahezu unerforscht. Diese Situation ist vor allem der Mangel an geeigneten Methoden, der Ermittlungen zu behindern.

Wir berichten über eine experimentelle Strategie, quantitativ und umfassend zu erforschen wie Stoffwechsel funktioniert, wenn eine Nährstoff als eine Mischung aus verschiedenen Moleküle, d. h., eine komplexe Ressource bereitgestellt wird. Hier beschreiben wir die Anwendung für die Beurteilung der Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff durch die Hefe metabolischen Netzwerkes. Der Workflow kombiniert bei stabiler Isotope Tracers Experimente mit ausgewählten ¹³C- oder ¹⁵N-markierten Substraten. Es besteht zunächst parallel und reproduzierbare Fermentationen in demselben Medium, beinhaltet eine Mischung aus N-haltige Moleküle; ausgewählten Stickstoffquelle ist jedoch jedes Mal beschriftet. Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) erfolgt die Kennzeichnung Muster gezielt Verbindungen zu bewerten und den Verbrauch und die Wiederherstellung von Substraten in anderen Metaboliten zu quantifizieren. Eine integrierte Analyse des kompletten Datensatzes gibt einen Überblick über das Schicksal der verbrauchten Substrate innerhalb der Zellen. Dieser Ansatz erfordert eine genaueste Protokoll für die Sammlung von Proben – erleichtert durch ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen – und die Erreichung der zahlreichen zeitaufwendige Analysen. Trotz dieser Einschränkungen erlaubt es, Verständnis, zum ersten Mal die Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff in der Hefe metabolischen Netzwerkes. Wir aufgeklärt die Umverteilung von Stickstoff aus reichlicher Quellen gegenüber anderen N-Verbindungen und die metabolische Ursprünge des flüchtigen Molekülen und proteinogene Aminosäuren bestimmt.

Introduction

Verständnis wie mikrobiellen Stoffwechsel funktioniert, ist ein zentrales Thema für die Gestaltung von effizienten Strategien zur Gärungsprozesse zu verbessern und die Produktion von fermentativen Verbindungen zu modulieren. Fortschritte in der Genomik und funktionelle Genomik in den letzten zwei Jahrzehnten weitgehend zur Erweiterung der Kenntnisse über die Topologie des metabolischen Netze in vielen Mikroorganismen beigetragen. Zugang zu diesen Informationen führten zu die Entwicklung von Konzepten, die für einen umfassenden Überblick über die Zellfunktionen¹abzielen. Diese Methoden setzen häufig auf eine modellbasierte Interpretation von messbaren Parametern. Diese experimentellen Daten beinhalten einerseits Metabolit Aufnahme und Produktion Preise und auf der anderen Seite quantitative intrazellulärer Informationen, der von Isotop Tracer vorliegt Experimente. Diese Daten liefern wichtige Informationen für den Abzug von der in-Vivo -Aktivität der verschiedenen Bahnen in einem definierten metabolischen Netzwerkes^2,3,4. Derzeit verfügbaren analytische Techniken ermöglichen nur die präzise Erkennung von Mustern von Molekülen beschriften, wenn ein Single-Element-Isotop mit und eventuell bei der Beschriftung mit zwei Isotopen Elementen zusammen. Darüber hinaus unter den meisten Wachstumsbedingungen besteht die Kohlenstoffquelle nur aus ein oder zwei Verbindungen. Infolgedessen wurden Ansätze beruhen auf ¹³C-isotopischen Tracer aus Kohlenstoff Substraten weit verbreitet und erfolgreich eingesetzt, um entwickeln ein umfassendes Verständnis der Kohlenstoff metabolischen Netzwerkes Operationen^{5,6,7 ,8}.

Im Gegensatz dazu in vielen natürlichen und industriellen Umgebungen, die verfügbarer Stickstoff-Ressource, die mikrobielles Wachstum unterstützt oft eine Vielzahl von Molekülen besteht aus. Zum Beispiel wird während der Gärung von Wein oder Bier, Stickstoff als eine Mischung aus 18 Aminosäuren und Ammonium bei variablen Konzentrationen⁹bereitgestellt. Dieses Array von N-Verbindungen, die zugänglich für Anabolismus sind macht diese komplexe Medien Bedingungen erheblich unterscheiden sich von denen üblicherweise für physiologische Untersuchungen, wie Letzteres erreicht werden mit einer einzigartigen Quelle von Stickstoff, in der Regel Ammonium.

Alles in allem verinnerlicht Stickstoff Verbindungen können direkt integriert in Proteine oder catabolized. Die Netzwerkstruktur des Stickstoff-Stoffwechsels in vielen Mikroorganismen, einschließlich der Hefe Saccharomyces Cerevisiae, ist sehr komplex, im Einklang mit der Vielfalt von Substraten. Schematisch, basiert dieses System auf die Kombination von den zentralen Kern des Stickstoff-Stoffwechsels fußenden von Glutamin, Glutamat und α-Ketoglutarate^10,11, Transaminasen und Deaminases katalysiert. Durch dieses Netzwerk Amin Gruppen aus Ammonium oder anderen Aminosäuren werden gesammelt und α-Keto-Säuren freigesetzt. Diese Zwischenprodukte sind auch dazu durch zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel (CCM)^12,13. Diese große Anzahl von verzweigten Reaktionen und Zwischenprodukte, beteiligt, der Abbau von exogenen Stickstoff Quellen und Anabolismus proteinogene Aminosäuren, erfüllt die anabole Anforderungen der Zellen. Die Aktivität durch diese miteinander verbundenen Routen führt auch die Ausscheidung von Stoffwechselprodukten. Insbesondere können α-Keto-Säuren umgeleitet werden, durch die Ehrlich Weg, höhere Alkohole und ihre Acetat Ester Derivate¹⁴, die wesentliche Mitwirkende zu den sensorischen Profile von Produkten sind zu produzieren. Anschließend spielt Funktionsweise Stickstoff-Stoffwechsel eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Biomasse und die Bildung von flüchtigen Molekülen (Aroma).

Die Reaktionen, Enzyme und Genen, die im Stickstoff-Stoffwechsel sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Jedoch ist die Frage der Verteilung von mehreren Quellen von Stickstoff in einem metabolischen Netzwerk noch nicht angesprochen worden. Es gibt zwei Hauptgründe, die erklären, dieser Mangel an Informationen. Zunächst wichtig angesichts der Stickstoff-Stoffwechsel-Netzwerk, eine große Menge von quantitativen Daten ist erforderlich für ein umfassendes Verständnis ihrer Tätigkeit, die nicht verfügbar war bis jetzt. Zweitens viele experimentelle Einschränkungen und Grenzen der analytischen Methoden verhindert die Umsetzung von Ansätzen, die zuvor für die Aufklärung der CCM-Funktion verwendet wurden.

Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen System-Ebenen-Ansatz zu entwickeln, der auf die Vereinbarkeit von Daten aus einer Reihe von isotopischen Tracer Experimenten basiert. Der Workflow enthält:
-Eine Reihe von Fermentationen durchgeführt, unter gleichen Umweltbedingungen, während eine andere ausgewählte Nährstoffe-Quelle (Substrat) jeweils gekennzeichnet ist.
-Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) für eine genaue Bestimmung, in verschiedenen Stadien der Gärung Restkonzentration von beschrifteten Substrat und die Konzentration und die Isotopen Anreicherung von Verbindungen, die von abgeleitet werden der Katabolismus der beschrifteten Molekül, einschließlich abgeleitete Biomasse.
-Eine Berechnung der Masse und Isotopen Waage für jede verbrauchte beschrifteten Molekül und eine weitere integrierte Analyse des Datasets, einen globalen Überblick über die Verwaltung von mehreren Nährstoffquellen durch Mikroorganismen durch die Bestimmung der Flux-Verhältnisse zu erhalten .

Um diese Methode anzuwenden, muss das reproduzierbare Verhalten des Stamm/Mikroorganismus zwischen den Kulturen Aufmerksamkeit geschenkt werden. Darüber hinaus müssen Proben aus verschiedenen Kulturen während der gleichen wohldefinierte Gärung Fortschritt entnommen werden. In der experimentellen Arbeit berichtet in dieser Handschrift dient ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen, um diese Einschränkungen zu berücksichtigen.

Darüber hinaus ist es wichtig, eine Reihe von beschrifteten Substrate (Verbindung, Natur und Position der Beschriftung) zu wählen, die an die wissenschaftliche Fragestellung der Studie geeignet ist. Hier wurden ¹⁵N beschriftet Ammonium, Glutamin und Arginin als die drei wichtigsten Stickstoff Quellen gefunden in Traubensaft ausgewählt. Dies ermöglichte es bewerten das Muster der Stickstoff Umverteilung von verbrauchten Verbindungen zu den proteinogene Aminosäuren. Wir wollten auch das Schicksal des Kohlenstoff-Backbones der verbrauchten Aminosäuren und deren Beitrag zur Produktion von flüchtigen Moleküle zu untersuchen. Um zu erreichen dieses Ziel, einheitlich ¹³C beschriftet Leucin, Isoleucin, Threonin und Valin in der Studie als Aminosäuren gehörten, die wichtige Zwischenprodukte des Ehrlich-Signalwegs abgeleitet sind.

Alles in allem, erkundeten wir quantitativ wie Hefe eine komplexe Stickstoff-Ressource verwaltet, durch eine exogene Stickstoff Quellen zur Erfüllung seiner anabolen Anforderungen während der Gärung beim zusätzlich entfernen das überschüssige Kohlenstoff Grundstoffe als Umverteilung flüchtige Moleküle. Die Versuchsdurchführung berichtet in diesem Papier kann angewendet werden, um andere mehrere Nährstoffquellen verwendet von anderen Mikroorganismus zu untersuchen. Es scheint ein geeigneter Ansatz für die Analyse der Auswirkungen der genetischen Hintergrund oder Umweltbedingungen auf die metabolischen Verhalten der Mikroorganismen zu sein.

Protocol

1. Gärung und Probenahme Erstellung von Medien und FermenterHinweis: Alle die Fermentationen sind parallel mit dem gleichen Stamm und durchgeführt in der gleichen chemisch definiert synthetisches Medium (SM, Zusammensetzung, die in Tabelle 1zur Verfügung gestellt), die enthält einer Mischungaus aus Ammonium und Aminosäuren als Stickstoff15Quellen. Für jede Gärung erfolgt eine einzelne Stickstoff-Verbindung ausschließlich in einem einheitlich…

Representative Results

Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Workflows, die implementiert wurde zur Untersuchung der Verwaltungs durch Hefe der Stickstoff mehrere Quellen, die während der Weingärung gefunden werden.Für verschiedene Punkte der Probenahme, der biologischen Parameter – Wuchsmerkmalen, Stickstoff Konsummuster und das Profil der proteinogene Aminosäuren – zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit unter Fermentationen (Abbildung 4…

Discussion

Quantifizierung der Partitionierung von Verbindungen durch metabolische Netzwerke mit isotopischen Tracer Experimente ist ein vielversprechender Ansatz für die Funktionsweise des mikrobiellen Stoffwechsels verstehen. Diese Methode kann nicht während erfolgreich mit ein oder zwei beschriftete Substraten angewendet derzeit implementiert werden, um Stoffwechsel von verschiedenen Quellen mit Hilfe mehrere beschriftete elementare Isotope (d.h. mehr als zwei Substrate) zu studieren. In der Tat, verfügbaren analytis…

Materials

D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological – acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological – basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers – Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702