Overlappende peptid Bibliotek kortlægge Qa-1 epitoper i et Protein
Summary
QA-1 (HLA-E i menneskelige) tilhører en gruppe af ikke-klassisk store histocompatibility komplekse 1b molekyler. Vaccination med Qa-1-bindende epitoper har vist sig at forøge væv-specifik immun regulering og rette op på flere autoimmune sygdomme. Heri beskrives en overlappende peptid bibliotek strategi til identifikation af Qa-1 epitoper i et protein.
Abstract
QA-1 (HLA-E i menneskelige) tilhører en gruppe af ikke-klassisk store histocompatibility komplekse 1b (MHC-Ib) molekyler. De seneste data tyder på, at Qa-1 molekyler spiller en vigtig rolle i landmåling celler til strukturelle og funktionelle integritet, inducerende immun forordning og begrænse immunrespons Virale infektioner. Derudover funktionelle augmentation af Qa-1-begrænset CD8+ T-celler gennem epitop immunisering har vist terapeutiske virkninger i flere autoimmune sygdom dyremodeller, fx eksperimentelle allergisk encephalomyelitis, kollagen induceret artritis, og ikke-overvægtig diabetes. Derfor er der et presserende behov for en metode, der kan effektivt og hurtigt identificere funktionelle Qa-1 epitoper i et protein. Her, vi beskriver en protokol, der udnytter Qa-1-begrænset CD8+ T-celle linier specifikke for en overlappende peptid (OLP) bibliotek til bestemmelse af Qa-1 epitoper i et protein. Denne OLP bibliotek indeholder 15-mer overlappende peptider, der dækker hele længden af et protein, og tilstødende peptider overlappe med 11 aminosyrer. Ved hjælp af denne protokol, identificeret vi for nylig en 9-mer Qa-1 epitop i myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). Dette nyligt tilknyttede MOG Qa-1 epitop blev vist sig at fremkalde epitop-specifikke, Qa-1-begrænset CD8+ T celler, forbedret myelin-specifik immun jf. Denne protokol er derfor nyttig for fremtidige undersøgelse af nye mål og funktioner af Qa-1-begrænset CD8+ T celler.
Introduction
QA-1 tilhører en gruppe af ikke-klassisk store histocompatibility komplekse 1b (MHC-Ib) molekyler i mus. Dens menneskelige homolog er HLA-E. Tidligere beviser har vist, at Qa-1 molekyler vigtige biologiske funktioner. For det første, Qa-1 molekyler spiller en vigtig rolle i landmåling celler til strukturelle og funktionelle integritet. I denne henseende har Qa-1 molekyler udviklet flere strategier til at overvåge den normale funktion af en celle. En sådan strategi giver Qa-1 molekyler til form komplekser med en forarbejdede leder peptid (epitop), dvs Qa-1 determinant modifier (Qdm), der er forarbejdet på basis af klassisk MHC-Ia molekyler i det endoplasmatiske reticulum1. Disse Qa-1/Qdm komplekser senere vises på overfladen af en celle og binde til hæmmende NKG2A receptorer på NK-celler til at hæmme NK dræbe aktivitet2. Hvis udtryk af MHC-Ia molekyler er tabt, bliver en celle (f.eks. en ondartet celle) følsom over for NK dræbe2. Anden strategien giver Qa-1 molekyler til at danne nye Qa-1/epitop komplekser på overfladen af en celle, der er mangelfuld i TAP (transporter tilknyttet antigen behandling)3 og/eller ERAAP (endoplasmatiske reticulum aminopeptidase tilknyttet antigen behandling)4 (begge mangler ofte forekommer i maligne celler). Den celle, der udtrykker disse nye Qa-1/epitop komplekser kan derefter blive anerkendt og elimineret af epitop-specifikke Qa-1-begrænset CD8+ T celler. For det andet fremkalde Qa-1 molekyler immun regulation5. I denne henseende Qa-1/epitop komplekser har vist sig at stimulere CD8+ regulerende T (langsomme) celler, der er vigtige for forebyggelse af immun-medieret beskadigelse af self-væv6,7,8 ,9,10. For det tredje, Qa-1-begrænset CD8+ langsomme celler har vist sig at begrænse immunrespons mod viral infektion11.
Derfor specifikke augmentation af epitop-specifikke Qa-1-restrictred CD8+ T celler er et potentielt lovende strategi for fjernelse af unormale celler, styrkelse af immunforsvaret regulering og kontrol af omfanget af virus-induceret immunrespons. Mens det er ikke fastslået om forstærkning af epitop-specifikke Qa-1-begrænset CD8+ T celler kan øge immune overvågning og begrænse virus-induceret immunrespons, vores laboratorier og andre har klart vist, at vaccination med Qa-1 epitoper kan forøge funktionen af Qa-1-begrænset CD8+ langsomme celler specifikke for patogene autoimmune CD4+ T celler, fører til effektiv kontrol af CD4+ T-celle-medieret autoimmune sygdomme i en række dyre modeller som eksperimentelle allergisk encephalomyelitis (en dyremodel af human multipel sklerose)6,10, kollagen induceret artritis (en dyremodel af human leddegigt)7, og ikke-fede diabetes (en dyremodel af human type 1 diabetes)8. Derudover har vi opdaget, at vaccination med en væv-specifikke Qa-1 epitop fører til specifikke kontrol af immun-medieret betændelse i dette væv gennem forstærkning af CD8+ langsomme celler12. De ovenstående succeser i prækliniske studier indikerer et behov for en fuld evaluering af Qa-1 epitop immunisering til behandling af væv-specifik immun-medierede sygdomme og potentielt til behandling af andre sygdomme forbundet med fejl og mangler i TAP og ERAAP.
Derfor er der et krav om en teknologi, der kan hurtigt og pålideligt analysere Qa-1 epitoper i et protein. I denne forbindelse er et begrænset antal biologisk vigtige Qa-1 epitoper blevet beskrevet. De fleste af disse Qa-1 epitoper blev identificeret serendipitously i løbet af undersøgelsen af CD8+ T celle svar til bakterier13, celler mangelfuld i TAP3, celler mangelfuld i ERAAP4og celler, der forårsager EAE6, 9. Derfor er en høj overførselshastighed teknik ønskeligt for identifikation af biologisk vigtige Qa-1 epitoper i et defineret protein. I følgende beskriver vi en overlappende peptid (OLP) bibliotek strategi, der knytter funktionelle Qa-1 epitoper i et protein ved hjælp af Qa-1-resrticted CD8+ T-celle linier specifikke for OLP pool (OLP_pool) af et protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet en protokol til at analysere Qa-1 epitoper i et protein. I forbindelse med denne protokol rapporteret flere andre strategier også tidligere. Første, allogene CD8+ T cellelinjer og kloner blev anvendt til identifikation af Qdm1. For det andet blev en formodede Qa-1-bindende motiv fra analysen af Qdm brugt til identifikation af HSP60p216-224 og en TCRBV8.1 epitop9,18. Tredje, individuelle overlappende peptid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Penelope Garcia for hendes teknisk bistand og forberedelse af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en forskning Innovation Grant (RIG) fra Institut for medicin på Loma Linda University (681205-2967) og en pilot tilskud fra National dissemineret sklerose samfundet (PP1685) til XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
