Libreria del Peptide per mappare gli epitopi di Qa-1 in una proteina di sovrapposizione
Summary
QA-1 (HLA-E nell’uomo) appartiene ad un gruppo di molecole complesse 1b non classici di istocompatibilità. Immunizzazione con gli epitopi Qa-1-associazione ha dimostrato di aumentare la regolazione immunitaria tessuto-specifici e migliorare diverse malattie autoimmuni. Qui descriviamo una strategia di libreria del peptide sovrapposti per l’identificazione di epitopi di Qa-1 in una proteina.
Abstract
QA-1 (HLA-E nell’uomo) appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib). Dati recenti suggeriscono che Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante in rilievo le cellule per l’integrità strutturale e funzionale, inducendo la regolazione immunitaria e limitando la risposta immunitaria alle infezioni virali. Inoltre, l’aumento funzionale della Qa-1-restricted CD8+ T cellule tramite epitopo immunizzazione ha mostrato effetti terapeutici in diversi modelli animali di malattia autoimmune, ad esempio l’encefalomielite allergica sperimentale, l’artrite indotta da collagene e diabete non obesi. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di un metodo che può efficacemente e rapidamente identificare gli epitopi in una proteina funzionali-Qa-1. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Qa-1-restricted CD8+ cellula T linee specifiche per una libreria peptidica (OLP) sovrapposti per determinare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. Questa libreria OLP contiene peptidi sovrapposti 15-mer che coprono tutta la lunghezza di una proteina, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi. Usando questo protocollo, abbiamo recentemente identificato un epitopo di Qa-1 9-mer alla della glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG). Questo appena mappata epitopo di MOG Qa-1 è stato indicato per indurre CD8 epitopo specifico, Qa-1-restricted+ T cellule che una maggiore regolazione immunitaria mielina specifici. Di conseguenza, questo protocollo è utile per la ricerca futura di nuovi bersagli e funzioni di Qa-1-restricted CD8+ T cellule.
Introduction
QA-1 appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib) in topi. Suo omologo umano è HLA-E. La prova precedente ha dimostrato che le molecole di Qa-1 hanno importanti funzioni biologiche. In primo luogo, Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante nel rilevamento topografico di cellule per integrità strutturale e funzionale. A questo proposito, Qa-1 molecole hanno evoluto strategie diverse per monitorare la funzione normale di una cella. Una tale strategia consente Qa-1 molecole per formare complessi con un peptide leader trasformati (epitopo), cioè il Qa-1 determinante modificatore (Qdm) che viene elaborato da molecole di MHC-Ia classiche nel reticolo endoplasmatico1. Questi complessi di Qa-1/Qdm successivamente visualizzano sulla superficie di una cellula e associare a recettori inibitori NKG2A sulle cellule NK per inibire NK uccidendo attività2. Se l’espressione di molecole MHC-Ia è perduto, una cella (ad es. una cellula maligna) diventa sensibile alla NK uccidendo2. L’altra strategia consente Qa-1 molecole per formare nuovi complessi di Qa-1/epitopo sulla superficie di una cellula che è carente in TAP (trasportatore associate all’elaborazione dell’antigene)3 e/o ERAAP (reticolo endoplasmico aminopeptidasi associati elaborazione dell’antigene)4 (entrambe le carenze si verificano spesso in cellule maligne). La cellula che esprime questi nuovi complessi di Qa-1/epitopo può quindi essere riconosciuta ed eliminata dall’epitopo specifico Qa-1-restricted CD8+ T cellule. In secondo luogo, Qa-1 molecole inducono regolazione immunitaria5. A questo proposito, Qa-1/epitopo complessi sono stati indicati per stimolare CD8+ cellule regolarici di T (Treg) che sono importanti per la prevenzione del danno immune-mediato di auto-tessuti6,7,8 ,9,10. In terzo luogo, Qa-1-restricted CD8+ Treg cellule sono state indicate per limitare le risposte immunitarie contro l’infezione virale11.
Pertanto, l’incremento specifico di epitopo specifico Qa-1-restrictred CD8+ T cellule è una strategia potenzialmente promettente per l’eliminazione delle cellule anormali, per il miglioramento della regolazione immune e per il controllo dell’entità del risposte immunitarie indotta da virus. Mentre esso non è stato determinato se l’incremento di epitopo specifico Qa-1-restricted CD8+ T cellule possono aumentare la sorveglianza immune e limitare le risposte immunitarie indotta da virus, i nostri laboratori e altri hanno dimostrato chiaramente che immunizzazione con gli epitopi Qa-1 può aumentare la funzione di Qa-1-restricted CD8+ Treg cellule specifiche per patogeni autoimmuni CD4+ T cellule, con conseguente controllo efficiente di CD4+ malattie autoimmuni T cellulo-mediata in un modelli di varietà di animali come encefalomielite allergica sperimentale (un modello animale della sclerosi multipla umana)6,10, artrite indotta da collagene (un modello animale dell’artrite reumatoide umana)7, e diabete non obesi (un modello animale del diabete di tipo 1 umano)8. Inoltre, abbiamo scoperto che l’immunizzazione con un epitopo di Qa-1 tessuto-specifici conduce al controllo specifico di infiammazione immune-mediata in quel tessuto attraverso l’aumento di CD8+ Treg cells12. I successi precedenti studi preclinici indicano la necessità di una valutazione completa di immunizzazione di epitopo Qa-1 per il trattamento di malattie immuno-mediate di tessuto-specifici e, potenzialmente, per la terapia di altre malattie connesse con le mancanze nel rubinetto e ERAAP.
Di conseguenza, esiste una domanda per una tecnologia che può attendibilmente e rapidamente analizzare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. A questo proposito, è stato descritto un numero limitato di epitopi Qa-1 biologicamente importanti. La maggior parte di questi epitopi di Qa-1 sono stata identificata serendipitously durante lo studio di CD8+ T cell responses to batteri13, le cellule carenti di rubinetto3, le cellule carenti di ERAAP4e le cellule che causano EAE6, 9. Pertanto, una tecnica di elevato throughput è auspicabile per l’identificazione di epitopi di Qa-1 biologicamente importanti in una proteina definita. Di seguito descriviamo una strategia di libreria del peptide (OLP) sovrapposti che esegue il mapping funzionali epitopi di Qa-1 in una proteina usando CD8 Qa-1-resrticted+ cellula T linee specifiche per il pool di OLP (OLP_pool) di una proteina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un protocollo per l’analisi di epitopi di Qa-1 in una proteina. In relazione al presente protocollo, parecchie altre strategie inoltre sono state segnalate precedentemente. In primo luogo, trapianto allogeneic CD8+ linee a cellula T e i cloni sono stati usati per l’identificazione del Qdm1. In secondo luogo, un motivo di Qa-1-legante presunto dall’analisi di Qdm è stato utilizzato per l’identificazione di HSP60p216-224 e un epitopo TCRBV8.19</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Penelope Garcia per la sua assistenza tecnica e la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca innovazione (RIG) dal dipartimento di medicina all’Università di Loma Linda (681205-2967) e un pilota grant dal National Multiple Sclerosis Society (PP1685) a XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
