キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価
Summary
ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々 な蛋白質の活性化をテストします。
Abstract
走化性、または、走化性因子のグラデーションを移行は、指示移行の最高の理解できるモードです。社会的なアメーバを用いた研究キイロタマホコリカビは並列経路の複雑なシグナル伝達ネットワーク走化性因子への応答を増幅し、偏ったアクチンの重合との仮足の突起が生じることを明らかにした、グラデーションの方向。対照的に、作用するせん断流れまたは電界への暴露による指示の移行などの他の種類の運転機構は知られていません。走化性の多くのレギュレータはローカリゼーションまたはグローバル刺激、走化性因子の活性化に一時的な変更を表示し同様、リーディング エッジまたは遅れエッジ移行細胞の局在を示します。指示移行の他の種類の分子機構を理解するには、せん断流れに (2-5 s) の簡単な露出に基づく急性の機械的刺激に対する細胞応答の検討を可能にする方法を開発しました。この刺激は、個々 のセルの動作を調べるバイオ センサーの蛍光標識を発現する細胞をイメージしながら、チャネルで配信できます。さらに、溶解し, プレートとエスディーエス興味の蛋白質のアクティブなバージョンを認識する抗体を使用してセル人口を刺激できます。両測定法を組み合わせることによって 1 つは変化細胞内局在および/またはリン酸化によって活性化分子の広い配列を調べることができます。このメソッドを使用して急性の機械的刺激が走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワークの活性化を引き起こすことを求めました。急性の機械的刺激に対する細胞応答を調べる機能せん断流動誘起運動に必要な開始のイベントを理解するために重要です。このアプローチは、走化性因子受容体の交絡影響なし走化性シグナル伝達ネットワークを勉強するためのツールを提供します。
Introduction
真核細胞の移行は水溶性または基質結合塩基のグラデーション、基板、電気フィールド、またはせん断流の可変剛性を含む環境の多様な化学と物理の合図によってバイアスされています。走化性を運転する分子機構の理解に多くの進歩をされているが、以下は指示移行と統合を生成する細胞レベルでこれらの多様な信号を統合する方法の他の種類について知られている渡り鳥応答。
監督、走化性因子の集積が進む方向への移動には行動の 3 つのコンポーネントが含まれます: 運動方向検出、極性1。運動は、仮足突起により細胞のランダムな動きを指します。方向性、走化性因子の原因を検出する細胞の能力は、センシングでも発生することができます細胞を固定化しました。極性は、リーディング エッジと運動の増加の永続につながる細胞の遅行エッジ間細胞内コンポーネントのより安定した非対称的な配分を指します。
4 つの概念上定義された制御ネットワークの活動に依存する、走化性因子への細胞応答: 受容体/極性1アクチン細胞骨格、シグナル伝達蛋白質 G。G タンパク質共役型受容体への走化性因子のバインドは、ヘテロ三量体 G タンパク質 α と βγ 方向信号を増幅する下流のシグナル伝達ネットワークを経由で信号を送信します。シグナル伝達ネットワーク内の複数経路並行行為し、アクチン細胞骨格ネットワーク バイアス アクチン重合とグラデーションの方向に、結果として仮足突起にフィードします。走化性の重要な規制当局の間では、しますグアニル酸シクラーゼ、ホスファターゼとは、テンシンの相同物 (PTEN) ホスホイノシチド 3-キナーゼ (PI3K) Ras GTPase、TorC2。シグナル伝達ネットワークの内で、およびシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワークをさらにフィードバック機構は、応答を増幅します。最後に、定義が不十分な極性ネットワークはアクチン細胞骨格から入力を受け、さらにグラデーションの方向で永続的な移行を促進するシグナル伝達ネットワーク バイアスがかかります。
走化性のメカニズム理解の多くは、制御ネットワークのさまざまなコンポーネントのタグ付きの蛍光バイオ センサーの開発のために可能になった。多くの走化性規制規制分子自体またはその活動の非対称的な配分があります。たとえば、認識バイオ アクティブ バージョンの小さな低分子量 g 蛋白質 Ras や Rap1-Ras 結合ドメイン (称します RBD) Raf1 のモデル、それぞれ-chemotaxing 携帯2,3のリーディング エッジにローカライズします。同様に、PI3K およびその製品ホスファチジルイノシトール (3,4,5)-三リン酸 (PIP3)、プレクストリン相同性 (PH) ドメインで認識もセル4、5の前面にローカリゼーションを表示します。対照的に、3 ホスファターゼ PTEN 変換 PIP3 ホスファチジルイノシトール (4, 5) に戻る-ビスリン酸、ローカライズ セル6のラギングの端に。重要なは、これらのバイオ センサーは、走化性因子とグローバルの刺激への応答への局在を変更します。ゾル性細胞質または皮質局在と欠席しているエッジ マーカーの遅れをとっているに対し、皮質に戻して静止細胞の突起の先端にリーディング エッジ マーカー静止細胞の突起の先端からなる後ゾル性細胞質刺激。バイオ センサー、走化性因子とグローバルの刺激への応答分布の解析は、運動と極性、観測をしばしば混同の貢献を最小化します。走化性因子、細胞懸濁液のグローバルまたは一様刺激はしばしばタンパク質リン酸化7,8,9によって検出される蛋白質のアクティブ化人口全体の変更を評価するツールとして使用も.顕微鏡制御ネットワークのさまざまなコンポーネントの動作に関する時間的・空間的情報を収集するために使用に対し主、この生化学的な試金は時間情報を取得する使用されます。
シグナル伝達ネットワークには、興奮性システム10,11の機能が組み込まれています。スープラしきい値走化性刺激に対する応答は「全か無か」であり、不応期が表示されます。応答が確率的に発生しても、振動現象を示すことができます。シグナル伝達イベント波12,13,14,15として伝播する大脳皮質の領域に局在しています。前面、または背面、マーカー、募集または伝播する波のアクティブ ・ ゾーンから切り離します。末尾のアクティブなゾーン ・難治性地域のため逆方向の波を彼らを満たして全滅させます。伝搬波の信号伝達細胞移行10を仲介する細胞の突起の根底にあります。
同じような調節機構が好中球とその他哺乳類の細胞の種類16 に該当するも、走化性については前述の多くはキイロタマホコリカビ、社会的なアメーバの研究から来た.細胞性粘菌単一細胞の何千もを最終的に胞子を含む多細胞の子実体を形成集計センターへ移行と飢餓では、堅牢な走化性応答のある確立されたモデル有機体をあります。走化性は、この生物の細菌の食料源を検索するための単一細胞の成長段階も重要です。重要なは、単一の細胞性粘菌の移行は、哺乳類の好中球または非常に急速なアメーバ型移行を受けるすべての転移性癌細胞の移行に似ています。実際には、両方全体的な制御ネットワークのトポロジと同様、走化性に関与する個々 のシグナル伝達経路の多くは、細胞性粘菌と哺乳類白血球17の間保存されます。さらに、線維芽細胞など、他のセルは、Gpcr; 代わりに受容器のチロシンのキナーゼ (RTK) を使用します。ただし、RTKs は同じようなネットワークにフィード可能性があります。
走化性と対照をなして指示移行の他の各種のモードを駆動する信号メカニズムの理解が欠けています。同様に細胞走化性因子のグラデーションで移行するいくつか報告されている活性化および/または局在アクチン重合、PIP3 および/または細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 1/2 を含む典型的なリーディング エッジ マーカーで、経るセルの前面は、作用するせん断流れまたは電界18,19,20,21の変更への応答で移行を指示しました。しかし、これらの研究の刺激に連続暴露も結果細胞遊走と疑問が残ったかどうか、具体的には、刺激に対する反応のリーディング エッジ マーカーのローカライズなど、または彼らは単にリーディング エッジにローカライズために移行するセルの前面に仮足数の増加。
人口レベルで両方のせん断流れと個々 のセル22として配信される急性の力学的摂動に対する細胞の反応を観察することができるアッセイを開発しました。走化性因子、急性 stimula グローバル刺激に似ていますせん断流のグローバリゼ-ションは、運動または極性から交絡の貢献をせず機械的刺激に対する細胞応答の研究をことができます。遺伝的または薬理学的摂動とこれらの生化学的および顕微鏡的アッセイを組み合わせることにより、私たちはどのように力学的刺激については、認識されて学ぶことして転送します。また、このアプローチはまた走化性因子、受容体/G からシグナル伝達とアクチン細胞骨格のネットワーク分離のない状態で走化性因子の受容体の下流のシステムへのタッピング法を提供しますタンパク質ネットワーク。
最近我々 は以下の方法を使用して、走化性シグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク22の複数のコンポーネントの活性化につながるその急性のせん断応力を示した。さまざまな間隔で急性の機械的刺激により、我々 は、同様にする走化性因子、力学的刺激に対する応答も展示下応答の全か無かの動作を含む、興奮性システムの機能実証飽和条件と不応期の存在。最後に、機械的、化学的刺激を組み合わせることによって示したシグナル伝達とアクチン細胞骨格ネットワーク、可能性があります複数バイアス細胞遊走刺激の統合を可能にする、2 つの刺激を共有します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、人口とせん断流れに対する個々 のセル動作の両方を評価するために便利な方法を提供しています。重要なは、以前の研究は、導くおよび移行中にエッジ マーカーをラギングの局在解析、現在のアプローチは鋭くせん断流を適用することによって即時の効果の調査をできます。このメソッドを使用して、実際には、せん断流れに細胞の初期応答必要がないこと細胞の?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所健康付与 R35 GM118177 PND によって支えられました。
Materials
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
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