Bedömning av Dictyostelium discoideum svar på akut mekanisk stimulering
Summary
Här beskriver vi metoder för bedömning av cellulära svar på akut mekanisk stimulering. I mikroskopi-baserade analysen undersöker vi lokalisering av fluorescently-märkta biosensorer kort stimulering med skeva flöde. Vi testar också aktivering av olika proteiner av intresse som svar på akut mekanisk stimulering biokemiskt.
Abstract
Kemotaxis, eller migration upp en gradient av en korrektiv, är bäst förstås läget riktad migration. Studier med sociala amöba Dictyostelium discoideum avslöjade att en komplex signaltransduktion nätverk av parallella vägar förstärker svaret till chemoattractants och leder till partiska aktin polymerisation och utskjutande delen av en pseudopod i den riktning för en övertoning. Däremot är molekylära mekanismer som driver andra typer av riktad migration, till exempel på grund av exponering för skeva flöde eller elektriska fält, inte kända. Många regulatorer av chemotaxisna uppvisar lokalisering på ledande eller släpar migrerar cellens kant, samt Visa övergående förändringar i lokalisering eller aktiveringen globala stimulering med en korrektiv. För att förstå de molekylära mekanismerna av andra typer av riktad migration utvecklat vi en metod som möjliggör undersökning av cellulära svar på akut mekanisk stimulering baserat på kort (2-5 s) exponering för skeva flöde. Denna stimulering kan levereras i en kanal medan imaging celler som uttrycker fluorescently-märkt biosensorer för att undersöka enskilda cellen beteende. Dessutom kan cell befolkningen stimuleras i en tallrik, lyserat, och immunoblotted med antikroppar som känner igen aktiva versioner av proteiner av intresse. Genom att kombinera båda analyser, kan man undersöka en rad olika molekyler som aktiveras av ändringar subcellulär lokalisering eller fosforylering. Med den här metoden vi fast beslutna att akut mekanisk stimulering utlöser aktivering av de kemotaktiska signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk. Möjlighet att undersöka cellulära svar till akut mekanisk stimulering är viktigt för att förstå primärhändelser som är nödvändiga för skjuvning flöde-inducerad motilitet. Detta tillvägagångssätt ger också ett verktyg för att studera kemotaktisk signaltransduktion nätverket utan störande påverkan av korrektiv receptorn.
Introduction
Migrering av eukaryota celler är påverkade av olika kemiska och fysiska ledtrådar i miljön, inklusive lutningar av lösliga eller substrat-bundna chemoattractants, variabla stelhet av substrat, elektriska fält eller skjuvning flöde. Även om det har gjorts många framsteg i vår förståelse av de molekylära mekanismer som driver Kemotaxis, mindre är känt om andra typer av riktad migration och hur dessa olika signaler integreras på cellulär nivå för att producera en enhetlig flyttande svar.
Regisserad migrering mot en ökande koncentrationen av en korrektiv innebär tre beteendemässiga komponenterna: motilitet, riktad avkänning och polaritet1. Motilitet refererar till slumpmässiga rörelsen av celler uppnås genom pseudopod utstick. Riktad avkänning är förmågan hos en cell att hitta källan till en korrektiv, vilket kan ske även i orörlig celler. Polaritet refererar till en mer stabil asymmetrisk fördelning av intracellulära komponenter mellan ledande och släpar kanten av en cell, vilket leder till ökad persistens i rörelse.
Cellulära svar på en korrektiv beror på aktiviteten av fyra begreppsmässigt definierade regleringsnät: receptorn / G protein, signaltransduktion, aktin cytoskelettet och polaritet1. Korrektiv bindande till G-proteinkopplade receptorn skickar signalen via heterotrimeric G proteiner α och βγ till downstream signalera transductionen nätverket, vilket förstärker directional signalen. Flera vägar inom nätverkets signaltransduktion agera parallellt och mata in i aktin cytoskelettet nätverket att bias aktin polymerisation och åtföljande pseudopod utstick, i riktning mot övertoningen. Bland viktiga regulatorer av chemotaxisna är Ras GTPase, TorC2, fosfoinositid 3-Kinas (PI3K), fosfatas och Tenzin homolog (PT) och guanylyl cyclase. Återkopplingsmekanismer inom nätverkets signaltransduktion och mellan signaltransduktion och aktin cytoskelettet nätverk ytterligare förstärka svaret. Slutligen, dåligt definierade polaritet nätverket tar emot input från aktin cytoskelettet och ytterligare biaskällor signaltransduktion nätverk för att främja ihållande migration i riktning mot övertoningen.
Mycket av vår mekanistisk förståelse av chemotaxisna var möjlig på grund av utvecklingen av fluorescently-märkta biosensorer för olika komponenter av de regulatoriska nätverk. Många chemotaxis tillsynsmyndigheter har en asymmetrisk fördelning av reglerande molekylen själv eller dess aktivitet. Till exempel biosensorer som känner igen aktiveras versioner av små GTPases Ras- och Rap1 – Ras-bindande domänerna i Raf1 (kallad RBD här) och RalGDS, respektive – lokalisera till framkanten av en chemotaxing cell2,3. Likaså, PI3K och dess produkt fosfatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), erkänd av en pleckstrin homologi (PH) domän, visar också lokalisering på framsidan av en cell4,5. Däremot en 3-fosfatas PTEN, som konverterar PIP3 tillbaka till fosfatidylinositol (4,5)-bisphosphate, lokaliserar till släpar kanten av cellen6. Ännu viktigare, ändra dessa biosensorer deras localization som svar på globala stimulering med en korrektiv. Leading edge markörer, som cytosoliska eller på tips av utbuktningar i en vilande cell, relocalize cortex, medan släpar kanten markörer, som har kortikala lokalisering och är frånvarande från tips av utbuktningar i en vilande cell, blir cytosoliska efter stimulering. Analys av biosensor fördelningen som svar på globala stimulering med en korrektiv minimerar motilitet och polaritet, som ofta förväxla observationerna bidrag. Globala eller enhetlig stimulering av en cellsuspension med en korrektiv används också som ett verktyg för att bedöma befolkningen-omfattande förändringar i protein aktivering, ofta upptäcks av protein fosforylering7,8,9 . Denna biokemiska analys används främst för att erhålla temporal information, medan mikroskopi används för att samla både tidsmässiga och rumsliga information om beteendet av olika komponenter av de regulatoriska nätverk.
Nätverkets signaltransduktion innehåller funktioner av en retbara system10,11. Svaren till supra-tröskel kemotaktisk stimuli är ”” och visar refraktärperioder. Svaren utlöses också stochastically och kan visa oscillerande beteende. Signaltransduktion händelser är lokaliserade till områden av hjärnbarken som propagerar som vågor12,13,14,15. Fram eller tillbaka, markörer rekryteras till, eller ta avstånd från, de aktiva zonerna av förökningsmaterial vågorna. På grund av eldfasta regionen avslutande aktiva zonen, förinta oppositely riktas vågorna som de möter. Förökningsmaterial signaltransduktion vågorna ligger bakom de cellulära utbuktningar som förmedlar cell migration10.
Mycket av den ovannämnda informationen på chemotaxis kom från studierna på den sociala amöban Dictyostelium discoideum, även om liknande regleringsmekanismer är också tillämpliga på neutrofiler och andra däggdjursceller typer16 . Dictyostelium är en väletablerad modellorganism som har en robust kemotaktisk svar under svält, när tusentals enstaka celler migrerar en aggregering mitten, så småningom bilda en flercelliga fruiting kropp som innehåller sporer. Chemotaxis är också väsentligt under den encelliga tillväxtfas av denna organism för att lokalisera bakteriell födokällor. Viktigt, är migration av enstaka Dictyostelium celler anmärkningsvärt liknande till migrationen av däggdjur neutrofiler eller metastaserande cancerceller, alla som genomgår mycket snabba amoeboid-typen migration. I själva verket bevaras både övergripande topologin för de regulatoriska nätverk, liksom många av de enskilda cellsmedierade reaktioner deltar i chemotaxis mellan Dictyostelium och däggdjur leukocyter17. Dessutom använda andra celler, till exempel fibroblaster, receptortyrosinkinaser (RTK) i stället för varandra; RTK kan dock matas in liknande nätverk.
I motsats till Kemotaxis saknas grundlig förståelse av de signalering mekanismer som driver olika andra lägen riktad migrationens. Likaså att cellerna migrerar i en korrektiv övertoning flera studier har rapporterat aktivering eller lokalisering av typiska framkant markörer, inklusive aktin polymerisation, PIP3 eller extracellulär signal-reglerade Kinas (ERK) 1/2, på den framsidan av celler som genomgår riktad migration svar på skeva flöde eller förändringar i elektriska fält18,19,20,21. I dessa studier resulterade kontinuerlig exponering för stimulans också dock i cellmigration, lämnar öppna frågan om, till exempel framkant markörerna lokalisera specifikt i respons på ett stimulus, eller om de helt enkelt lokalisera i framkant på grund av ökat antal pseudopods på framsidan av en migrera cell.
Vi utvecklade analyser som tillåter oss att iaktta celler reagerar på akut mekanisk störning levereras som skjuvning flöde både på populationsnivå och som enskilda celler22. Liknar globala stimulering med en korrektiv, akut sktion med skeva flöde tillåter studier av cellulära svar på en mekanisk stimulering utan förbryllande bidrag från motilitet eller polaritet. Att kombinera dessa biokemiska och mikroskopiska analyser med genetiska eller farmakologiska störningar gör det möjligt för oss att lära oss om hur mekaniska stimuli uppfattas och genomlysning. Dessutom ger denna metod också en ny metod för att trycka in i systemet nedströms av korrektiv receptorn i avsaknad av en korrektiv, därmed isolera de signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk från receptorn/G protein nätverk.
Med hjälp av tekniker som beskrivs nedan vi nyligen visat att akut shear stress leder till aktivering av flera komponenter av kemotaktisk signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk22. Genom att tillämpa den akuta mekanisk stimulansen med varierande mellanrum, visade vi att, på samma sätt till chemoattractants, svar på mekaniska stimuli uppvisar också dragen av en retbara systemet, inklusive beteendet för svaret under mättar villkor och närvaron av en refraktärperiod. Slutligen, genom att kombinera mekanisk och kemisk stimulering vi visade att de två stimuli signal transduktion och aktin cytoskelettet nätverk, som sannolikt möjliggör integration av flera stimuli att bias cellmigration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderna som beskrivs här erbjuda ett bekvämt sätt att bedöma både befolkningen och enskild cell beteende som svar om du vill skeva flöde. Viktigare, medan tidigare studier analyseras lokalisering av leder och släpar kanten markörer under migreringen, tillåter den nuvarande strategin utredning av omedelbara effekter genom att tillämpa skjuvning flödet akut. Med den här metoden visat vi att, i själva verket det första svaret av celler till shear flöde inte kräver cellmigration. I stället föregår den sn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Institutes of Health grant R35 GM118177 till PND.
Materials
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
References
- Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
- Jeon, T. J., Lee, D. -. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
- Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
- Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell’s Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
- Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
- Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
- Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
- Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
- Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
- Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
- Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
- Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
- Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
- Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
- Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
- Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
- Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
- Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
- Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
- Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
- Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
- Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
- Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
- Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
- Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
- Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).
