Avidin-बायोटिन प्रणाली के साथ गैर आनुवंशिक सतह सजावट के माध्यम से माइकोबैक्टीरियम bovis बीसीजी वैक्सीन में Exogenous एंटीजन की अभिव्यक्ति
Summary
एक जीवाणु की सतह पर तेजी से प्रतिजन प्रदर्शन के लिए एक उपंयास तकनीक प्रस्तुत किया है, जो सतह biotinylation monomeric avidin के साथ संलयन में ब्याज की प्रोटीन के लिए जोखिम के बाद शामिल है । चयनित प्रतिजनों के साथ बीसीजी लोड हो रहा है सफलतापूर्वक अपनी immunogenicity में सुधार, सुझाव है कि सतह सजावट पारंपरिक आनुवंशिक दृष्टिकोण बदल सकते हैं ।
Abstract
तपेदिक (टीबी) एक गंभीर संक्रामक रोग है और केवल उपलब्ध वैक्सीन एम. bovis बैसिलस Calmette-Guérin (बीसीजी) सुरक्षित और बच्चों की गंभीर टीबी दिमागी बुखार और प्रसार किया टीबी के कुछ रूपों के खिलाफ संरक्षण के लिए प्रभावी है, लेकिन की रक्षा करने में विफल रहता है फुफ्फुसीय टीबी के खिलाफ, जो रोग का सबसे प्रचलित रूप है । होनहार रणनीतियों में सुधार करने के लिए वर्तमान में या तो immunodominant एम. तपेदिक (एमटीबी)-विशिष्ट प्रतिजनों और/या प्रतिजन को उत्तेजित करेगा कि सह कारकों कूटबंधन जीन के साथ पूरक के जीन के साथ अपने परिवर्तन पर भरोसा कक्ष प्रस्तुत कर रहा है । इन तरीकों के लिए प्रमुख सीमाएं कम दक्षता, कम स्थिरता, और अभिव्यक्ति वैक्टर की सुरक्षा के अनिश्चित स्तर शामिल हैं । इस अध्ययन में, हम वैक्सीन सुधार के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो plasmids एंकोडिंग इसी जीन के साथ परिवर्तन के बजाय बैक्टीरिया की सतह पर ब्याज की exogenous प्रोटीन के साथ बीसीजी पूरकता के होते हैं । सबसे पहले, ब्याज की प्रोटीन मानक ई. कोलाई अभिव्यक्ति प्रणालियों में monomeric avidin के साथ फ्यूजन में व्यक्त कर रहे है और फिर biotinylated बीसीजी की सतह को सजाने के लिए इस्तेमाल किया । पशु प्रयोग बीसीजी सतह का उपयोग कर सरोगेट ovalbumin प्रतिजन के साथ सजाया प्रदर्शित करता है कि संशोधित जीवाणु पूरी तरह से immunogenic और विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण में सक्षम है । कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत डेटा दृढ़ता से एक उपंयास और वर्तमान बीसीजी वैक्सीन कि exogenous न्यूक्लिक एसिड के साथ पूरकता के श्रमसाध्य पारंपरिक दृष्टिकोण की जगह देने के लिए कुशल विधि का समर्थन करते हैं ।
Introduction
विभिंन रणनीतियों वर्तमान टीबी वैक्सीन बीसीजी की जगह प्रस्तावित किया गया है, जिसमें प्रोटीन सहायक सिस्टम, वायरल वैक्टर प्रौद्योगिकियों, तनु जी एम टीबी उपभेदों, और आनुवंशिक रूप से संशोधित बीसीजी उपभेदों, या तो जीन परिचय अधिक-व्यक्त बीसीजी एंटीजन संक्रमण के दौरान पर्याप्त रूप से व्यक्त नहीं कर रहे हैं कि1 या एमटीबी-विशिष्ट एंटीजन में बीसीजी2मौजूद नहीं है. आनुवंशिक इंजीनियरिंग, हालांकि, सुरक्षा के अनिश्चित स्तर, समय लेने वाली प्रक्रिया, और अभिव्यक्ति की कम क्षमता वैक्टर4,5सहित कई बाधाओं का सामना । साथ बीसीजी में सुधार करने का संबंध है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए अनिश्चित आनुवंशिक प्रत्यावर्तन की आवश्यकता के बिना immunogenicity में सुधार की जरूरत है ।
इस अध्ययन में, हम बीसीजी कोशिका की सतह पर ब्याज की संयोजक प्रोटीन के प्रदर्शन के लिए एक उपंयास रणनीति है कि अच्छी तरह से जाना जाता उच्च संबंध avidin के साथ संपर्क पर आधारित है परिचय । इस दृष्टिकोण biotinylated बीसीजी की सतह पर संयोजक avidin फ्यूजन प्रोटीन की तेजी और प्रतिलिपि लगाव की अनुमति देता है, जो बीसीजी के व्यापक जोड़तोड़ की सुविधा को अपनी उत्कृष्ट सुरक्षा बनाए रखते हुए इसकी प्रभावकारिता में अधिक से अधिक सुधार प्राप्त करने के लिए रिकॉर्ड, उपयोग के दशकों में मनाया ।
बायोटिन के लिए Avidin संबध अत्यंत उच्च है (Kd = 10− 15 एम) और एक बार गठित, बायोटिन-Avidin जटिल बहुत स्थिर है और केवल denaturing शर्तों के तहत बाधित किया जा सकता है6. हालांकि, इस प्रकार की बातचीत के लिए एक जीन हस्तांतरण विधि वैकल्पिक, दीर्घकालिक लेकिन संयोजक प्रोटीन की प्रतिवर्ती प्रदर्शन के रूप में सेवा के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, हम यहां पेश एक कम अपनत्व monomeric avidin (Kd = 10− 7 एम) कि प्रोटीन की प्रतिवर्ती रिहाई की ओर जाता है सतह से सजाया बीसीजी एक बार के अंदर किया जाता है प्रतिजन कोशिकाओं को पेश । आदेश में अवधारणा का सबूत प्रदान करने के लिए, हम इस विधि का परीक्षण एक monomeric avidin chimeric प्रोटीन एक किराए ovalbumin (ओवा)7,8से व्युत्पंन प्रतिजन के लिए इसी का उपयोग कर । परिणामों से पता चला कि बीसीजी सेल की सतह को आसानी से और तेजी से monomeric avidin फ्यूजन प्रोटीन के साथ सजाया जा सकता है और यह है कि बीसीजी सतह के लिए बाध्यकारी बैक्टीरियल विकास और अस्तित्व में detectable परिवर्तन के बिना स्थिर और प्रतिलिपि है । इसके अलावा, हमने पाया है कि बीसीजी के साथ monomeric avidin के साथ जुड़े ओवा (AviOVA) एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समान प्रेरित कर सकते है कि बीसीजी आनुवंशिक रूप से दोनों विट्रो में और vivo मेंएक ही प्रतिजन व्यक्त करने के लिए । बैक्टीरियल सतह पर ब्याज की प्रोटीन के प्रतिवर्ती प्रदर्शन की यह तकनीक इसलिए पारंपरिक जीन हस्तांतरण के दृष्टिकोण का एक प्रभावी प्रतिस्थापन है और बीसीजी के व्यापक जोड़तोड़ और वैक्सीन में आगे अनुप्रयोगों के लिए एक मंच प्रदान कर सकते है विकास.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम इस अध्ययन में रिपोर्ट बीसीजी सतह पर exogenous प्रोटीन के तेजी से और प्रभावी प्रदर्शन के लिए एक गैर आनुवंशिक दृष्टिकोण या तो विशिष्ट प्रतिजनों या विशिष्ट कार्यात्मक गुणों को कुशलता से जीवाणु की immunogenicity में ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
तकनीकी सहायता के लिए बीसीजी पाश्चर तनाव और तलाल के लिए हम डॉ॰ आर स्टोक्स का धन्यवाद करते हैं । हम भी जीन संश्लेषण के साथ मदद के लिए GenScript धन्यवाद ।
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
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