Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos
Summary
Descreveremos um protocolo para gerar proliferando e quiescentes fibroblastos dérmicos humanos primários, taxas de decomposição de transcrição de monitoramento e identificação de genes diferencialmente em decomposição.
Abstract
Quiescência é um estado temporário, reversível, em que células cessaram a divisão celular, mas mantém a capacidade de proliferar. Vários estudos, incluindo a nossa, têm demonstrado que a quiescência está associada a generalizada alterações na expressão gênica. Algumas destas mudanças ocorrem através de alterações no nível ou atividade associada a proliferação de factores de transcrição, tais como E2F e MYC. Nós demonstramos que o decaimento do mRNA também pode contribuir para alterações na expressão gênica entre células proliferando e quiescentes. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para estabelecer culturas quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos prepúcio dérmica. Em seguida, descrevemos os procedimentos para inibir nova transcrição em células proliferando e quiescentes com actinomicina D (ActD). ActD tratamento representa uma abordagem simples e reprodutível para desassociar nova transcrição do decaimento de transcrição. Uma desvantagem da fatura de tratamento é que o curso de tempo deve ser limitado a um curto espaço de tempo porque ActD afeta a viabilidade celular. Níveis de transcrição são monitorados ao longo do tempo para determinar as taxas de decomposição de transcrição. Este procedimento permite a identificação de genes e isoformas que apresentam deterioração diferencial em proliferando contra fibroblastos quiescentes.
Introduction
Níveis de estado estacionário de transcrições refletem a contribuição de decaimento de transcrição e síntese de transcrição. Regulamentada e coordenada transcrição decaimento é um importante mecanismo para controlar processos biológicos1,2,3,4. Por exemplo, taxas de decomposição de transcrição foram mostradas para contribuir para a série temporal de eventos após a ativação pela citoquina inflamatória fator de necrose tumoral5.
Mostramos anteriormente que a transição entre a proliferação e quiescência em fibroblastos humanos primários está associada a alterações dos níveis de transcrição de muitos genes6. Algumas destas mudanças refletem as diferenças na atividade de fatores de transcrição entre estes dois Estados.
Mudanças na taxa de decaimento de uma transcrição também podem contribuir para as alterações do nível de expressão de uma transcrição em dois Estados diferentes7,8. Baseado em nossos achados anteriores que a transição entre a proliferação e quiescência está associada a alterações nos níveis de vários microRNAs9, perguntamos se existe também uma contribuição do decaimento de transcrição diferencial nas alterações em expressão gênica em proliferando contra fibroblastos quiescentes.
A fim de monitorar a estabilidade de transcrição, determinamos a taxa de decaimento de transcrições todo o genoma em proliferando contra células quiescentes. Para conseguir isso, temos monitorado taxas de decaimento em proliferando contra fibroblastos quiescentes introduzindo um inibidor da nova transcrição e monitorar a taxa em que as transcrições individuais desapareceram ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que, em comparação com métodos que simplesmente monitorar geral expressão gênica, inibindo a síntese de transcrição novo, seremos capazes de determinar a taxa de decaimento para essas transcrições separadamente da taxa em que forem transcrito.
ActD tratamento para inibir a transcrição de nova e determinar taxas de decaimento de transcrição tem sido aplicado com sucesso em vários estudos anteriores. ActD tem sido usada para dissecar a importância da estabilidade de RNA nas mudanças na abundância de transcrição que resultam do tratamento com citocinas pró-inflamatórias5. Uma abordagem similar também tem sido utilizada para dissecar as diferenças na taxa de decaimento de transcrição em proliferando contra células diferenciadas de C2C12 como a adoptarem uma diferenciada músculo fenótipo10. Como outro exemplo, global mRNA meias-vidas também foram detectados em pluripotentes e tronco embrionárias diferenciadas do mouse células11. Nestes exemplos, decaimento do mRNA tem demonstrado ser importante para a regulação da abundância de transcrição e para a transição de células a célula diferentes Estados.
Aplicando os métodos descritos abaixo, descobrimos que mudanças nas taxas de decomposição de transcrição em aproximadamente 500 genes quando comparando os fibroblastos em proliferação e quiescente Estados12. Em particular, nós descobrimos que os destinos do microRNA miR-29, que é ativador nas células quiescentes, são estabilizados quando células de transição de quiescência. Aqui descrevemos a metodologia que usamos para determinar taxas de deterioração nas células proliferando e quiescentes. Esta metodologia é útil para comparar taxas de decaimento do mRNA global em duas distintas mas condições semelhantes quando é solicitada informação sobre decaindo rapidamente os genes. Ele também pode ser usado para abordar outras questões tais como o efeito das condições de cultura celular na decadência de transcrição, por exemplo, em duas dimensões contra três culturas dimensionais. Taxas de decomposição podem ser determinado genoma-largo com métodos como microarrays ou RNA-Seq. Alternativamente, em tempo real qPCR ou mancha do Norte pode ser usada para determinar as taxas de decomposição de forma gene-por-gene ou isoform-por-isoforma. Estas taxas podem ser usadas para calcular a meia-vida de cada gene monitorado e identificar genes com taxas de decomposição que são diferentes em duas condições.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quiescência pode ser induzida por sinais externos, incluindo a retirada de mitógenos ou soro, falta de aderência de célula e inibição de contato. Inibição de contato, um dos vários métodos possíveis para indução de quiescência, é um processo altamente evolutivamente conservado em que células sair do ciclo celular proliferativo em resposta ao contato célula a célula. Aqui focamos na inibição de contato como um exemplo de um método para induzir quiescência. Estudos anteriores relataram que contato cé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC foi o estudioso Milton E. Cassel da Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabalho foi financiado por subsídios para HAC, do Instituto Nacional de ciências médicas de geral centro da concessão excelência GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, nacional Science Foundation Grant OCI-1047879 agosto de David, Instituto Nacional de General Medical Sciences R01 GM081686, Instituto Nacional de ciências médicas gerais R01 GM0866465, o Eli & Edythe Broad centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais, centro de saúde/UCLA CTSI NIH das mulheres Iris Cantor Grant UL1TR000124 e a leucemia linfoma sociedade. Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde sob prêmio número P50CA092131. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. HAC é um membro do Eli & Edythe amplo centro de medicina regenerativa & investigação em células estaminais, o Instituto de Biologia Molecular de UCLA e o programa interdepartamental de bioinformática da UCLA.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
