Bestemmelse af Genome-wide udskrift henfald priser i prolifererende og inaktiv humane fibroblaster
Summary
Vi beskriver en protokol til generere prolifererende og inaktiv primære human dermal fibroblaster, overvågning udskrift henfald priser, og at identificere varierende rådnende gener.
Abstract
Udbrudsfronten er en midlertidig, vendbar tilstand, hvor celler er ophørt celledeling, men bevarer evnen til at formere. Flere undersøgelser, herunder vores, har vist, at udbrudsfronten er forbundet med omfattende ændringer i genekspression. Nogle af disse ændringer ske gennem ændringer i niveauet eller aktivitet af spredning-associerede transskriptionsfaktorer, såsom E2F og MYC. Vi har demonstreret, at mRNA i tænderne kan også bidrage til ændringer i genekspression mellem prolifererende og inaktiv celler. I denne protokol beskrive vi proceduren for etablering af prolifererende og inaktiv kulturer af human dermal forhuden fibroblaster. Vi derefter beskrive procedurer for hæmme nye transskription i prolifererende og inaktiv celler med Actinomycin D (ActD). ActD behandling repræsenterer en ligetil og reproducerbar metode til miljøomkostningerne nye transskription fra udskrift forfald. En ulempe ved ActD behandling er, at tid kurset skal være begrænset til en kort tidsramme, fordi ActD påvirker cellernes levedygtighed. Udskrift niveauer overvåges over tid til at bestemme udskrift henfald priser. Denne procedure giver mulighed for identifikation af gener og isoformer, der udviser differential forfald i prolifererende versus inaktiv fibroblaster.
Introduction
Steady state niveauer af udskrifter afspejler både udskrift syntese og udskrift henfald bidrag. Reguleret og koordineret udskrift henfald er en vigtig mekanisme til at kontrollere biologiske processer1,2,3,4. For eksempel, har udskrift henfald priser vist sig at bidrage til den tidsmæssige serie af begivenhederne efter aktivering af inflammatorisk cytokin tumor nekrose faktor5.
Vi har tidligere vist, at overgangen mellem spredning og ubevægelighed i primære humane fibroblaster er forbundet med ændringer i afskriften niveauer af mange gener6. Nogle af disse ændringer afspejler forskelle i aktiviteten af transkriptionsfaktorer mellem disse to stater.
Ændringer i en udskrift henfaldet kan også bidrage til ændringer i niveauet udtryk af en udskrift i to forskellige stater7,8. Baseret på vores tidligere resultater, at overgangen mellem spredning og ubevægelighed er forbundet med ændringer i niveauet af flere MicroRNA9, spurgte vi, om der er også et bidrag fra differential udskrift forfald i ændringer i genekspression i prolifererende versus inaktiv fibroblaster.
For at overvåge udskrift stabilitet, bestemt vi sats henfald af udskrifter genome-wide i prolifererende versus inaktiv celler. For at opnå dette, overvåges vi henfald priser i prolifererende versus inaktiv fibroblaster ved at indføre en hæmmer af nye transskription og overvåge den sats som enkelte afskrifter forsvandt over tid. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at vi i forhold til metoder, der blot overvåger samlede Gen-ekspression, ved at hæmme ny udskrift syntese, vil kunne bestemme henfaldet for disse udskrifter adskilt fra den hastighed, hvormed de er transskriberet.
ActD behandling at hæmme nye transskription og bestemme udskrift henfald priser har været anvendt med succes i flere tidligere undersøgelser. ActD har været brugt til at dissekere betydningen af RNA stabilitet i ændringerne i afskriften overflod, som følge af behandling med pro-inflammatoriske cytokiner5. En lignende fremgangsmåde er også blevet brugt til at dissekere forskelle i afskriften henfaldet i prolifererende versus differentierede C2C12 celler, som de vedtager en differentieret muskel fænotype10. Som et andet eksempel, globale mRNA halveringstider er også blevet påvist i pluripotente og differentieret mus embryonale stamceller-celler11. I disse eksempler, har mRNA forfald vist sig at være vigtigt for at regulere udskrift overflod og for overgang af celler til forskellige celle stater.
Anvende de nedenfor beskrevne metoder, opdagede vi ændringer i afskriften henfald priser i ca 500 gener, når man sammenligner fibroblaster i prolifererende og inaktiv stater12. Navnlig, opdagede vi, at mål de microRNA, miR-29, som er downregulated i inaktiv celler, er stabiliseret når celler overgang til ubevægelighed. Vi beskriver her metoden til at bestemme henfald priser i prolifererende og inaktiv celler. Denne metode er nyttig til sammenligning globale mRNA henfald priser i to særskilte men lignende betingelser, når der anmodes om oplysninger om hastigt rådnende gener. Det kunne også bruges til at behandle andre spørgsmål såsom virkningen af celle kultur betingelser på udskrift henfald, for eksempel, i to dimensionelle versus tre dimensionelle kulturer. Henfald priser kan være beslutsom genome-wide med metoder som microarrays eller RNA-FF. Alternativt, real-time qPCR eller nordlige blotting kan bruges til at bestemme henfald satser på grundlag af genet af genet eller isoform af isoform. Disse satser kan derefter bruges til at beregne halveringstiden for hver overvåget gen og at identificere gener med forfald satser, der er forskellige i de to betingelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubevægelighed kan være fremkaldt af eksterne signaler, herunder inddragelse af mitogens eller serum, manglende celle vedhæftning og kontakt hæmning. Kontakt hæmning, en af flere mulige metoder for at fremkalde ubevægelighed, er en yderst evolutionært bevarede proces hvor celler frakørsel proliferativ cellecyklus i svar til celle til celle kontakt. Her fokuserer vi på kontakt hæmning som et eksempel på en metode til at fremkalde ubevægelighed. Tidligere undersøgelser har rapporteret at celle-celle kontakt kan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC var Milton E. Cassel lærd af Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbejde blev finansieret af tilskud til HAC fra National Institute of General Medical Sciences Center af Excellence grant P50 GM071508 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 til David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of General Medical Sciences R01 GM0866465, at Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin & stamcelleforskning, Iris Cantor Women’s Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, og leukæmi lymfom Society. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. HAC er medlem af Eli & Edythe bred Center for regenerativ medicin & stamcelleforskning, UCLA Molekylærbiologisk Institut og UCLA Bioinformatik mellemtjenstlig Program.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
