أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em> رابطة الدول المستقلة</em> -prenyltransferase في<em> الإشريكية القولونية</em
Summary
بروتوكول بسيط ل أوفيركسريسيون وتنقية من كودون الأمثل، رابطة الدول المستقلة الإنسان -prenyltransferase، في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة، من إشريشيا القولونية ، جنبا إلى جنب مع فحص النشاط الأنزيمي. هذا البروتوكول يمكن تعميمها لإنتاج البروتينات الأخرى prenyltransferase cis- في كمية ونوعية مناسبة للدراسات الميكانيكية.
Abstract
برينيلترانزفيراسيس (بت) هي مجموعة من الانزيمات التي تحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسفات اليليك باستخدام إيسوبنتينيل ثنائي الفوسفات (إيب) عن طريق تفاعلات التكثيف متعددة. ددس (ديهيدرودوليتشيل ثنائي فسفات سينثيز) هو سلالة طويلة الأجل حقيقية سيس -PT (تشكيل رابطة الدول المستقلة رابطة مزدوجة من رد فعل التكثيف) الذي يحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسيل فارنيسيل (فب، ثنائي فوسفات الألييك) عن طريق التكثيف متعددة مع ثنائي إيسوبنتنيل ثنائي الفوسفات (إيب). ددس هي ذات أهمية طبية حيوية، كما طفرة غير متحفظة (K42E) في الإنزيم يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي ، مما يؤدي في النهاية إلى العمى. ولذلك، تم تطوير هذا البروتوكول من أجل الحصول على كميات كبيرة من ددس تنقيته، ومناسبة للدراسات الميكانيكية. هنا، تم استخدام استخدام الانصهار البروتين، وتحسين ظروف الثقافة وكودون الأمثل للسماح أوفيركسريسيون وتنقية دسدز الإنسان نشط وظيفيا في <eم> E. القولونية. بروتوكول وصفها هو بسيط، فعالة من حيث التكلفة والوقت تجنيب. تماثل سيس -PT بين الأنواع المختلفة تشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك، مثل تلك المشاركة في تركيب المطاط الطبيعي.
Introduction
برينيلترانزفيراسيس هي مجموعة من الانزيمات التي تحفز استطالة سلسلة من ثنائي فوسفات اليليك باستخدام إيسوبنتينيل ثنائي الفوسفات (إيب) عن طريق التفاعلات التكثيف متعددة 1 ، 2 . إنزيمات Z- نوع تحفيز تشكيل رابطة الدول المستقلة رابطة مزدوجة من رد فعل التكثيف، في حين أن E- نوع الإنزيمات تحفيز تشكيل رابطة مزدوجة عبر 3 . رابطة الدول المستقلة -Prenyltransferases (-PT رابطة الدول المستقلة، Z-نوع الإنزيمات) وكلاسيكي تصنف وفقا لطول سلسلة منتجاتها إلى قصيرة السلسلة (C 15)، متوسطة سلسلة (C 50-55)، وسلسلة طويلة (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl ثنائي فسفات سينسيز) هي حقيقية النواة سلسلة طويلة من رابطة الدول المستقلة -PT أن يحفز سلسلة من استطالة ثنائي فسفات farnesyl (FPP، وهو ثنائي فسفات allylic) عن طريق تكثفات متعددة مع ثنائي فسفات isopentenyl (IPP) 1، 5 ، 6 . وهذا يؤدي إلى تشكيل ديهيدرودوليتشيل ثنائي الفوسفات، و C 55-100 ثنائي فوسفات البولي بروبيلين بمثابة مقدمة ل دوليشيلبيروفوسفات، جليكوسيل الناقل جزيء تشارك في N- ربط البروتين غليكوسيلاتيون 1 . بين اليهود الأشكناز، طفرة غير متحفظة (K42E) في نتائج ددس في راثي متنحية التهاب الشبكية الصباغي 7 ، 8 . لذلك، تم تطوير هذا البروتوكول من أجل الحصول على ددس تنقيته مناسبة للدراسات الميكانيكية.
يعتبر الإشريكية القولونية المضيف الأكثر ملاءمة وفعالة من حيث التكلفة للتعبير البروتين المؤتلف، وبالتالي هو أيضا المضيف الأكثر استخداما. ومع ذلك، عندما يحاول المرء البروتينات أوفيركسريس غير متجانسة في E. القولونية ، ينبغي أن تؤخذ الاعتبارات الخاصة بالبروتين. الحصول على مطوية بشكل صحيح، نشطe البروتينات المؤتلف من E. القولونية ، ليست مسألة بسيطة بسبب خصائص متميزة من البروتينات المختلفة. وقد وضعت نهج عديدة للتغلب على هذه العقبات. هنا، تم استخدام استخدام الانصهار البروتين، وتحسين ظروف الثقافة وكودون الأمثل للسماح أوفيركسريسيون وتنقية ددس البشري نشط وظيفيا في E. القولونية . من ملاحظة، كانت محاولة سابقة ل أوفيركسريس الخميرة رابطة الدول المستقلة -PT دون انصهار البروتين ناجحة بسبب عدم القابلية للذوبان كاملة حتى في وجود المنظفات 12 . بروتوكول وصفها هو بسيط، فعالة من حيث التكلفة، والوقت تجنيب ويسمح للمرء الحصول على الاستعدادات ددس مناسبة للدراسات الميكانيكية. ونظرا لتناظر سيس -PT بين الأنواع المختلفة، نقترح أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على غيرها من رابطة الدول المستقلة حقيقية النواة -PT كذلك.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول وصفها هنا لتنقية ددس البشري وظيفية في E. خلايا القولونية بسيطة وفعالة، والسماح لأحد أوفيركسريس وتنقية البروتين في 3 – 4 أيام مرة واحدة في بناء مناسب هو متاح. هذه البروتوكولات لتنقية البروتين ذات أهمية خاصة نظرا للاختراقات في تسلسل الجينوم، والتي قدم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مركز التميز العلمي في مؤسسة العلوم الإسرائيلية (I-كور) في علم الأحياء الخلوي الهيكلي (1775/12) ومؤسسة العلوم الإسرائيلية تمنح 1721/16 و 2338/16 (ي) و 825/14 (دك) ). إن الدعم الذي تقدمه مؤسسة أراضي الإقليم إلى جمهورية الكونغو الديمقراطية هو محل تقدير كبير. تم تنفيذ هذا العمل من قبل ايلان إدري وميشال غولدنبرغ في الوفاء الجزئي لمتطلبات أطروحة دكتوراه في الطب من كلية ساكلر الطب، جامعة تل أبيب.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
