Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem
Summary
Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.
Abstract
Gekweekte knaagdier hersenen segmenten zijn handig voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire werking van neuronen en glia in een omgeving die veel van hun normale in-vivo -interacties onderhoudt. Segmenten die zijn verkregen uit een verscheidenheid van transgene muis lijnen of gebruik van virale vectoren voor expressie van fluorescently tagged proteïnen of verslaggevers in wild type hersenen segmenten toestaan voor hoge resolutie beeldvorming door fluorescentie microscopie. Hoewel verschillende methoden zijn ontwikkeld voor de beeldvorming van de hersenen segmenten, segment cultuur te combineren met de mogelijkheid voor het uitvoeren van heeft repetitieve high-resolution beeldvorming van specifieke cellen in levende segmenten over lange perioden problemen opgeleverd. Dit is vooral waar wanneer virale vectoren worden gebruikt voor de expressie van exogene eiwitten omdat dit het best in een gesloten systeem gebeurt ter bescherming van gebruikers en voorkoming van kruisbesmetting. Eenvoudige modificaties aan de roller buis hersenen segment cultuur methode die voor de repetitieve high-resolution beeldvorming van segmenten in vele weken in een gesloten systeem zorgen worden gemeld. Het kweken van segmenten op photoetched coverslips staat het gebruik van fiducial merken snel en nauwkeurig verplaatsen in het werkgebied naar het identiek veld image na verloop van tijd vóór en na verschillende behandelingen. Voorbeelden staan voor het gebruik van deze methode in combinatie met specifieke neuronale kleuring en meningsuiting te observeren van veranderingen in het hippocampal segment platform, virale-gemedieerde neuronale expressie van fluorescente proteïnen en de ontwikkeling van cofilin pathologie, die werd eerder waargenomen in de hippocampus de ziekte van Alzheimer (AD) in reactie op de behandeling van het segment met oligomeren van amyloid-β (Aβ) peptide.
Introduction
Primaire cultuur van gedissocieerde neuronen uit regio’s van knaagdier hersenen is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt door onderzoekers te observeren van de reacties op pathologically betrokken prikkels. Dergelijke studies hebben echter het nadeel van neuronen in enige 2D en zonder hun gliale steunregeling kijken. Bovendien, tenzij geteeld onder omstandigheden van zeer hoge dichtheid (640 neuronen/mm2 of ongeveer 16% van de oppervlakte) waarin het onmogelijk is te volgen de willekeurige uitvloeisel van een dendriet of axon voor meer dan een korte afstand van de cel lichaam, hippocampal neuronale levensvatbaarheid daalt meer dan 4 weken aanzienlijk1, beperking van het gebruik van gedissocieerde culturen voor uitgebreide studies van leeftijdsgebonden aandoeningen. Het kweken van segmenten van knaagdier hersenen bereid is een aantrekkelijke optie die deze beperkingen overwint door het behoud van een georganiseerde cel architectuur en levensvatbaarheid voor weken of maanden. Voorwaarden voor het behoud van vele verschillende regio’s van knaagdier hersenen in segment cultuur geweest beschreven2.
Twee methoden worden veel gebruikt voor langetermijnkweek van hersenen segmenten: kweken op membranen op de lucht-liquid interface3 of kweken op coverslips in verzegelde buizen kan draaien in een incubator van de roller om beluchting4. Segmenten gekweekt op membranen kunnen rechtstreeks worden beeld met hoge-resolutie fluorescentie microscopie via een rechtop Microscoop en water onderdompeling doelstellingen5. Als alternatief, plakjes gekweekt op membranen zijn overgedragen aan glazen bodem gerechten om goede oplossing van dendritische spines met behulp van een omgekeerde Microscoop6te bereiken. Echter zijn beide methoden van imaging segmenten geteeld op membranen open systemen die vereisen middellange wijzigingen en vaak Antimycoticum en/of antibiotica te gebruiken om te voorkomen of verminderen van verontreiniging5,6. Segmenten op een membraan op de lucht-medium-interface onderhouden uitstekende morfologie en overleving, maar terug te keren naar exacte locaties tijdens herhaalde beeldvorming bij hoge vergroting is uiterst moeilijk, tenzij het experiment alleen kleine groepen van cellen volgt geeft uiting aan een fluorescerende marker. Hoewel segmenten geteeld op membranen zijn gebruikt met virale-gemedieerde expressie van transgenen5,6, vereist bioveiligheid protocollen een gesloten cultuur-systeem worden gebruikt voor bepaalde virale vectoren die worden gebruikt voor uitdrukken van fluorescently geëtiketteerde eiwitten en verslaggevers van celfysiologie. Bovendien vereisen de onderdompeling doelstellingen decontaminatie tussen monsters die wordt gevolgd in cultuur5. Een belangrijke toepassing van membraan interface culturen is het combineren van high-resolution beeldbewerking met electrofysiologie op keer punten7.
De roller buis methode met coverslips in de kunststof buis niet elke electrofysiologie of hoge resolutie imaging zonder het verwijderen van het dekglaasje aan toe. Dus, deze methode is meestal vereffend langetermijnstudies waarin na fixatie opmerkingen hebben gesteld8. Hier wordt beschreven, is een methode die maakt gebruik van de roller techniek voor de cultuur van de buis maar op geboord-out buizen met plakjes op coverslips die herhaaldelijk beeld kan worden voor zo lang als de culturen worden gehandhaafd. Het gesloten systeem vereist geen middellange verandering voor imaging en maakt gebruik van photoetched coverslips om fiducial merken waarmee imaging op hoge vergroting, na dagen of weken, de precieze velden eerder beeld.
Wij hanteren deze methode te onderzoeken van wijzigingen in het knaagdier zeepaardje, een grote hersenen regio betrokken bij geheugen en leren. De knaagdieren hippocampus is vaak bestudeerd als een model voor pathologische of leeftijd-gerelateerde veranderingen waargenomen tijdens de ontwikkeling van cognitieve stoornissen9, zoals die zich in AD voordoen. Onze methode is bijzonder goed geschikt voor het bestuderen van pathologische veranderingen die zich binnen een enkel sneetje na verloop van tijd in reactie op veranderingen in het milieu, zoals verhogingen in Aβ peptides ontwikkelen, die is kenmerkend voor AD8. Een pathologie, gekoppeld aan menselijke en knaagdier AD brein is de aanwezigheid van cofilin-actine aggregaten en staven, de laatste met bundels van filamenten waarin cofilin en actine zijn in een 1:1 verhouding van de molaire10,11,, 12. staven zijn waargenomen in vaste segmenten van rat hippocampus na Aβ behandeling, alsmede binnen een segment van de levende knaagdieren hersenen cofilin-GFP onderworpen aan hypoxie8uitdrukken, en zij kunnen bijdragen tot de synaptische dysfunctie gezien in AD en beroerte. Hier gebruiken we deze nieuwe kweken methode om het observeren van het tijdsverloop en de distributie in de segmenten van uitgedrukt exogene chimeer fluorescente proteïnen die leidt door verschillende virussen. Vervolgens gebruiken we de neuronale specifieke uitdrukking van een cofilin verslaggever construct te volgen van de ontwikkeling van cofilin staaf en statistische Pathologie in hippocampal plakjes in reactie op behandeling met oplosbare Aβ oligomeren (Aβo).
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode van de roller-buis zorgt voor langdurige kweken en hoge resolutie live beeldvorming van gesneden hersenweefsel. Een groot probleem met het segment techniek zoals hier toegepast is in de montage en het onderhoud van segmenten. Dekglaasje aan coatings die ondersteuning bieden voor segment adhesie, bevorderen segment uitdunnen door het versterken van de uitgroei van neurites en migratie van de cellen van het segment; zo voorkomen we het gebruik van deze substraten. Het inbrengen van amino groepen …
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
