רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה
Summary
הציגו כאן היא שיטת צינור רולר ששונה culturing, לסירוגין דימות ברזולוציה של המוח מכרסמים פרוסות בשבועות רבים עם שינוי מיקום מדויק על photoetched coverslips. הכדאיות עצביים, מורפולוגיה פרוסה מתוחזקים היטב. יישומים של השיטה במלואו סגור באמצעות וירוסים עבור ביטוי מסוים סוג התא הינם מסופקים.
Abstract
פרוסות המוח מכרסמים בתרבית שימושיים הלומדים את ההתנהגות תאית ומולקולרית של נוירונים, עכשיו, דונלד סביבה המתחזק רבים של האינטראקציות שלהם נורמלי ויוו . פרוסות המתקבל מגוון של קווים העכבר הטרנסגניים או השימוש וקטורים נגיפי עבור ביטוי של חלבונים fluorescently מתויגות או כתבים פרוסות המוח פראי סוג לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. למרות פותחו מספר שיטות הדמיה פרוסות המוח, שילוב התרבות פרוסה עם היכולת לבצע דימות ברזולוציה חוזרות של תאים ספציפיים בפרוסות בשידור חי על פני תקופות זמן ארוך יש היוותה בעיות. הדבר נכון במיוחד כאשר נגיפי וקטורים משמשים עבור ביטוי של חלבונים אקסוגני מאז זה נעשית בתוך מערכת סגורה כדי להגן על המשתמשים ולמנוע זיהום לחצות. פשוט השינויים שבוצעו בשיטת תרבות רולר פרוסה המוח צינור לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה חוזרות של פרוסות במשך שבועות רבים במערכת סגורה מדווחים. Culturing פרוסות על photoetched coverslips מאפשר את השימוש סימני fiducial למיקום במהירות ובדיוק את הבמה כדי תמונה של שדה זהים לאורך זמן לפני ואחרי טיפולים שונים. דוגמאות מוצגים עבור השימוש בשיטה זו בשילוב עם מכתים עצביים מסוימים, ביטוי לבחון שינויים בארכיטקטורת פרוסה בהיפוקמפוס ויראלי בתיווך ביטוי עצביים של חלבונים פלורסנט, הפיתוח של פתולוגיה cofilin, אשר נצפתה בעבר בהיפוקמפוס של מחלת אלצהיימר (AD) בתגובה לטיפול פרוסה עם oligomers של פפטיד עמילואיד-β (Aβ).
Introduction
התרבות העיקרי של נוירונים הפומבית מאזורים במוח מכרסמים היא כלי חשוב משמשים חוקרים לבחון את התגובות באופן פתולוגי בהפרות גירויים. אולם, מחקרים כאלה יש החיסרון להסתכל על נוירונים בדו מימד בלבד וללא מערכת תמיכה גליה שלהם. יתר על כן, אלא אם כן גדל בתנאים של צפיפות גבוהה מאוד (640 מ”מ/נוירונים2 או כ- 16% של שטח פנים) אותה הופכת בלתי אפשרי לעקוב את תוצר אקראי של דנדריט או האקסון יותר במרחק קצר מן הגוף תא, בהיפוקמפוס הכדאיות עצביים מעל 4 שבועות מסרב באופן משמעותי1, הגבלת השימוש של תרבויות הפומבית ללימודים מורחבים של פתולוגיות הקשורות לגיל. Culturing הפרוסות מקריסטלים של המוח מכרסמים הוא אופציה אטרקטיבית מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שמירה של ארכיטקטורה התא מאורגן ואת הכדאיות במשך שבועות או חודשים. תנאים לשמירה על אזורים שונים רבים של המוח מכרסמים בתרבות פרוסה כבר מתואר2.
שתי שיטות העיקריים נמצאים בשימוש נרחב עבור תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח: culturing על ממברנות אוויר נוזלי ממשק3 או culturing על coverslips צינורות אטום הרשאה עושה סיבוב חממה רולר לספק אוורור4. פרוסות תרבותי על ממברנות יכול לדימות ישירות עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה פלורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ זקופה של מים טבילה מטרות5. לחלופין, פרוסות תרבותי על ממברנות הועבר לטיפולו כלי הזכוכית התחתונה כדי להשיג ברזולוציה טובה של הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה של6. עם זאת, שתי שיטות הדמיה פרוסות גדל על ממברנות הן מערכות פתוחות דורשים שינויים בינוני, לעתים קרובות להשתמש פטריות ו/או אנטיביוטיקה כדי למנוע או להפחית זיהום5,6. פרוסות על קרום-הממשק אוויר-בינוני לשמור על הישרדות ומורפולוגיה מעולה, אך חוזרים שוב ושוב אל מיקומים מדויקים במהלך דימות חוזרות בהגדלה גדולה היא משימה קשה ביותר, אלא אם הניסוי הוא בעקבות קבוצות קטנות בלבד של תאים הבעת סמן פלורסנט. למרות פרוסות גדל על ממברנות השתמשו בביטוי ויראלי בתיווך של5,transgenes6, פרוטוקולי אבטחה עשויה לדרוש מערכת תרבות סגורה להיות מועסק מסוימים וקטורים ויראלי המשמשים עבור ביטוי fluorescently מתויגות חלבונים ו כתבים של פיזיולוגיה של התא. יתר על כן, מטרות טבילה דורשים טיהור בין הדגימות שהופיעו לאחר מכן תרבות5. יישום מרכזי אחד של תרבויות ממשק ממברנה היא שילוב הדמיה ברזולוציה גבוהה עם אלקטרופיזיולוגיה-פעם נקודות7.
שיטת צינור רולר עם coverslips בתוך צינור פלסטיק אינו מתיר כל אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה ברזולוציה גבוהה מבלי להסיר את coverslip. לכן, בשיטה זו הוחלה לרוב על מחקרים ארוכי טווח שבו קיבוע שאחרי תצפיות שנעשו8. המתוארים כאן היא שיטה מנצל את הטכניקה תרבות של שפופרת רולר, אך על צינורות קדח-אאוט עם פרוסות על coverslips זה יכול לדימות שוב ושוב ככל התרבויות נשמרים. מערכת סגורה דורש שינוי בינונית עבור הדמיה, מנצל photoetched coverslips לספק סימני fiducial לאפשר הדמיה בהגדלה גדולה, לאחר ימים או שבועות, השדות מדויק בעבר עם תמונה.
אנו מיישמים שיטה זו לבחון שינויים בהיפוקמפוס מכרסמים, אזור מרכזי המוח המעורבים זיכרון ולמידה. מכרסמים ההיפוקמפוס הוא למד לעיתים קרובות כמודל עבור שינויים פתולוגיים או הקשורות לגיל נצפתה במהלך הפיתוח של פגיעה קוגניטיבית9, כגון אלה המתרחשות לספירה. השיטה שלנו מתאימה במיוחד ללמוד שינויים פתולוגיים להתפתח בתוך פרוסה אחת לאורך זמן בתגובה לשינויים סביבתיים, כגון העלאות Aβ פפטידים, אשר מאפיינת של המודעה8. פתולוגיה אחד המשויך מכרסמים ואנושי המוח לספירה היא הנוכחות של cofilin-אקטין אגרגטים והם מוטות, חבילות המכילות האחרון של חוטים cofilin, אקטין 1:1 יחס טוחנת10,11, 12. נצפו מוטות פרוסות קבוע של ההיפוקמפוס עכברוש לאחר הטיפול Aβ, כמו גם בתוך פרוסה המוח מכרסם חי לבטא cofilin-GFP נתון היפוקסיה8, הם עשויים לתרום תפקוד סינפטית ראיתי במודעה וקו. כאן אנו משתמשים culturing שיטה חדשה להתבונן על מסלול הזמן והפצה בתוך פרוסות של ביטוי חלבונים אקסוגני chimeric פלורסנט שהוצגו על ידי נגיפים שונים. אנחנו ואז לנצל את הביטוי הספציפי עצביים של מבנה הכתב cofilin לעקוב אחר ההתפתחות של cofilin רוד, פתולוגיה צבירה בפרוסות בהיפוקמפוס בתגובה לטיפול עם Aβ מסיסים oligomers (Aβo).
Protocol
Representative Results
Discussion
צינור רולר השיטה המתוארת כאן מאפשר לטווח ארוך culturing והדימות ברזולוציה גבוהה בשידור חי של רקמת המוח הפרוס. בעיה גדולה אחת עם טכניקה פרוסה כפי שהוא מיושם כאן הוא הרכבה ותחזוקה של פרוסות. ציפויים Coverslip התומכים אדהזיה פרוסה, לקדם פרוסה דליל על ידי שיפור את המוצלח neurites והעברה של תאים מחוץ הפרוסה…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
