Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per immunofluorescenza intero supporto e basate su immagine quantitativa analisi volumetrica degli embrioni del mouse in fase precoce. Presentiamo questa tecnica come un potente approccio qualitativamente e quantitativamente valutare strutture cardiache durante lo sviluppo e proponiamo che possa essere ampiamente adattabile ad altri sistemi dell’organo.
Abstract
L’uso di tecniche di imaging continuo progresso ha contribuito largamente alla nostra comprensione aumentata dello sviluppo embrionale. Due ambiti di ricerca che hanno notevolmente beneficiato di questi progressi, grazie all’elevata qualità dei dati che possono essere ottenuti direttamente da embrioni pre-impianto di imaging o ex vivo organi organogenesi e sviluppo pre-impianto. Mentre gli embrioni pre-impianto hanno dato i dati con particolarmente elevata risoluzione spaziale, fasi successive sono state meno favorevoli alla ricostruzione tridimensionale. Acquisizione dati 3D o volumetrici di alta qualità per strutture embrionali conosciute in combinazione con destino mapping o l’analisi genetica lignaggio permetterà per un’analisi più completa degli eventi morfogenetici che si svolgono durante l’embriogenesi.
Questo protocollo descrive un metodo di immunofluorescenza intero-monta che permette per l’etichettatura, la visualizzazione e la quantificazione delle popolazioni di cellule progenitrici entro la mezzaluna cardiaca in via di sviluppo, una struttura chiave formato durante lo sviluppo del cuore. L’approccio è disegnato in un modo che è possibile ottenere sia le informazioni sul livello delle cellule e dei tessuti. Mediante microscopia confocale ed elaborazione dell’immagine, questo protocollo permette per ricostruzione spaziale tridimensionale della Mezzaluna cardiaca, fornendo in tal modo la capacità di analizzare la localizzazione e l’organizzazione delle popolazioni specifiche progenitrici durante Questa fase critica dello sviluppo del cuore. D’importanza, l’uso degli anticorpi di riferimento consente successivo mascheramento della Mezzaluna cardiaca e successive misurazioni quantitative delle aree all’interno della mezzaluna. Questo protocollo non consentirà solo di un esame approfondito dello sviluppo iniziale di cuore, ma con adattamenti dovrebbe essere applicabile alla maggior parte dei sistemi dell’organo in gastrula di embrione di topo fase somite precoce.
Introduction
Lo studio dell’organogenesi ha a lungo invocato l’osservazione di eventi morfogenetici nell’embrione di sviluppo. Questi studi si basano spesso sull’uso di coloranti fluorescenti o lignaggio traccia reporter in combinazione con l’etichettatura delle popolazioni di riferimento definito. 1 confrontando le posizioni relative di queste etichette, informazioni possono essere raccolte sull’origine, il movimento o il contributo finale di una popolazione di interesse. Trapianto e gli esperimenti di mappatura del destino utilizzano punti di riferimento morfologici o iniezione di coloranti in linee cellulari non motili per definire il punto di partenza delle celle di interesse, che vengono poi esaminati per il contributo all’embrione sviluppato. 2 , 3 , 4 , 5 esperimenti genetici di lignaggio traccia utilizzano lo stesso concetto con alleli di reporter ben definite che vengono utilizzati per le popolazioni delle cellule etichetta senza manipolazione sperimentale. Chiave di questi approcci è la capacità di determinare, con elevata risoluzione spaziale, le posizioni di sperimentale e le etichette di riferimento. Questi approcci hanno prodotto eccezionali progressi nello sviluppo di pre-impianto ed explant studi di organogenesi. 6 , 7 , 8 , 9
Gli eventi inerenti allo sviluppo che sono alla base della morfogenesi del cuore sono state descritti sempre più bene negli ultimi anni. 10 una delle scoperte più importanti in questo settore di ricerca è la descrizione di un certo numero di popolazioni di cellule progenitrici che può essere distinta dall’espressione di indicatori unici. 11 queste popolazioni sono il primo e il secondo campi di cuore (FHF e SHF), che sono presenti all’interno della Mezzaluna cardiaca sul lato anteriore dell’embrione al giorno embrionale (E) 8.25 dello sviluppo del mouse. 12 queste popolazioni sono frequentemente esaminate attraverso una combinazione di microscopia del largo-campo, che fornisce informazioni a livello di tessuto e sezionamento seriale con analisi di immunofluorescenza, che offre alta risoluzione cellulare ma solo informazioni spaziali bidimensionali. 13 in tal senso, mentre questi studi notevolmente hanno avanzato la nostra comprensione dello sviluppo di cuore, i metodi disponibili hanno limitato in profondità analisi quantitativa della morfogenesi durante queste fasi, creando la necessità di approcci esaminare la organizzazione di queste popolazioni a livello di intero-organismo.
I recenti progressi in microscopia confocale e analisi d’immagine 3D consentono per ricostruzioni algoritmici ad alta risoluzione e ad alta produttività di cellule e strutture in situ con relativa facilità, spianando così la strada per studi dettagliati del complesso strutture cellulari. 14 con l’aumento della potenza di calcolo e lo sviluppo di algoritmi gestione di grandi quantità di dati, entrambi necessari per gestire l’aumento esponenziale delle dimensioni del set di dati, di imaging analisi possono essere completamente automatizzati. 15 analisi automatizzata di imaging di insiemi di dati ha il vantaggio di essere imparziale, ma solo è affidabile come la qualità del set di dati di input; è indispensabile, quindi, che le migliori pratiche sono utilizzate durante l’acquisizione e pre-l’elaborazione immagine per garantire la massima qualità, analisi imparziale. 16 protocolli possono essere completamente automatizzate e condivisa per la riproducibilità, e gli algoritmi utilizzati dal software proprietario sono prontamente disponibili tramite librerie per essere utilizzato da scienziati che hanno familiarità con moderne proprietarie o open-source strumenti di sviluppo. 17
Il seguente protocollo vengono illustrati i passaggi necessari per eseguire tali analisi su un modello ben definito di organogenesi, la formazione della Mezzaluna cardiaca durante lo sviluppo del cuore. In particolare, questo protocollo descrive come (1) raccogliere e sezionare embrioni in fase crescente cardiaca, (2) eseguire l’intero supporto immunofluorescenza per riferimento (Nkx2-5) e sperimentale (Foxa2Cre:YFP18,19) marcatori, (3) preparare e gli embrioni usando la microscopia confocal, di immagine e infine (4) analizzare e quantificare le immagini risultanti utilizzando approcci avanzati tridimensionali. Mentre la mezzaluna cardiaca viene utilizzata come esempio qui, con modifica appropriata, questo protocollo può essere usato per l’analisi di stirpi multipli in gastrula di embrioni in fase precoce somite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra descrive una strategia per ottenere dati quantitativi da immagini di alta qualità intero supporto immunofluorescenza degli embrioni del mouse post-impianto. Se eseguita correttamente, i dati volumetrici 3D generati con la procedura utilizzabile per l’analisi comparativa e Intersezionali di più domini all’interno dell’embrione. Il segnale superficiale approccio descritto di mascheratura è di particolare utilità durante l’analisi di popolazioni di cellule romanzo rispetto alle strutture di ri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH/NHLBI R56 HL128646 e il Mindich Child Health and Development Institute (MCHDI) a ISMMS (a N.D.). E.B. è supportato da un HD075735 di NIH/NIDCR tirocinio T32. Microscopia e analisi delle immagini è stata eseguita il nucleo di microscopia presso la scuola di medicina di Icahn sul Monte Sinai, che è sostenuta in parte dal Tisch Cancer Institute presso la Mount Sinai P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
