Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner
Summary
Her, beskriver vi en protokol for hele mount immunofluorescens og image-baserede kvantitative volumetrisk analyse af tidlige fase mus embryoner. Vi præsenterer denne teknik som en kraftfuld tilgang til kvalitativt og kvantitativt vurdere hjerte strukturer under udvikling, og foreslår, at det kan være meget tilpasses andre organsystemer.
Abstract
Brugen af nogensinde fremme Billeddannende teknikker har bidraget bredt til vores øget forståelse af embryonale udvikling. Præ-implantation udvikling og organogenesis er to områder af forskning, der har nydt høj grad fra disse fremskridt, på grund af den høje kvalitet af data, der kan opnås direkte fra imaging præ-implantation embryoner eller ex vivo organer. Mens præ-implantation embryoner har givet data med særlig stor rumlig opløsning, har senere faser været mindre modtagelig for tre-dimensionelle genopbygning. Opnåelse af høj kvalitet 3D eller volumetriske data for kendte embryonale strukturer i kombination med skæbne mapping eller genetiske afstamning sporingen vil give mulighed for en mere omfattende analyse af de morfogenetiske begivenheder finder sted under embryogenese.
Denne protokol beskriver en helhed-mount immunofluorescens tilgang, der giver mulighed for mærkning, visualisering og kvantificering af stamfader cellepopulationer i udvikle hjerte crescent, en central struktur dannet under hjertet udvikling. Fremgangsmåde er udformet på en sådan måde, at både celle – og tissue-niveau oplysninger kan rekvireres. Brug Konfokal mikroskopi og billedbehandling, denne protokol giver mulighed for tre-dimensionelle rumlige genopbygning af den kardiale halvmåne, hvilket giver mulighed for at analysere lokalisering og organisation af specifikke stamfader befolkninger under denne kritiske fase af hjertet udvikling. Vigtigere, brug af reference antistoffer giver mulighed for efterfølgende maskering af den kardiale Halvmåne og efterfølgende kvantitative målinger af områder inden for Halvmåne. Denne protokol vil ikke kun gøre det muligt for en detaljeret gennemgang af tidlige hjerte udvikling, men med tilpasninger bør finde anvendelse på de fleste organsystemer i gastrula til tidlige somite fase mus embryo.
Introduction
Studiet af organogenesis har længe påberåbt sig observation af morfogenetiske begivenheder i den embryo under udvikling. Disse undersøgelser er ofte afhængige brug af fluorescerende farvestoffer eller afstamning sporingen journalister i kombination med mærkning af definerede reference populationer. 1 ved at sammenligne relative positioner af disse etiketter, oplysninger kan blive forstået på oprindelse, bevægelse eller ultimate bidrag af en population af interesse. Transplantation og skæbne kortlægning eksperimenter bruge enten morfologiske vartegn eller injektion af farvestoffer i ikke-motile lineages for at definere udgangspunktet for cellerne i interesse, som derefter undersøges for bidrag til de udviklede embryoner. 2 , 3 , 4 , 5 genetiske afstamning sporingen eksperimenter brug det samme koncept med veldefinerede reporter alleler, der bruges til at mærke cellepopulationer uden eksperimentelle manipulation. Nøglen til disse tilgange er evnen til at bestemme, med høj rumlige opløsning, placeringen af den eksperimentelle og reference etiketter. Disse tilgange har givet fremragende fremskridt i præ-implantation udvikling og explant organogenesis undersøgelser. 6 , 7 , 8 , 9
De udviklingsmæssige begivenheder, der ligger til grund for hjertet morfogenese har været i stigende grad godt beskrevet i de seneste år. 10 en af de store opdagelser i denne del af forskningen er beskrivelsen af et antal stamfader populationer, der kan adskilles ved ekspression af unikke markører. 11 disse populationer omfatter den første og anden hjerte felter (FHF og SHF), som er til stede i den hjerte Halvmåne på den forreste side af embryoet på embryonale dag (E) 8,25 mus udvikling. 12 disse befolkningsgrupper behandles ofte gennem en kombination af wide-felt mikroskopi, som indeholder væv-niveau information, og seriel skæring med immunofluorescens assays, der tilbyder høj cellulære opløsning men kun to-dimensionelle geografisk information. 13 således, mens disse undersøgelser har meget avancerede vores forståelse af hjertet udvikling, de tilgængelige metoder har begrænset i dybden kvantitativ analyse af morfogenese under disse faser, skaber behovet for tilgange til at undersøge de tilrettelæggelsen af disse befolkninger på et hele-organisme niveau.
De seneste fremskridt inden for både Konfokal mikroskopi og 3D billedanalyse giver mulighed for høj opløsning og høj overførselshastighed algoritmisk rekonstruktioner af celler og strukturer i situ med relativ lethed, dermed bane vejen for detaljerede undersøgelser af komplekse cellulære strukturer. 14 med forhøjelsen af datakraft og udviklingen af store-data administrerende algoritmer, begge er nødvendige for at håndtere den eksponentielle stigning i størrelsen af imaging datasæt, analyser kan nu være fuldt automatiseret. 15 automatiseret analyse af imaging datasæt har fordel af at være neutral, men det er kun så pålidelig som kvaliteten af det input datasæt; derefter, er det nødvendigt, at bedste praksis anvendes under erhvervelse og billede forbehandling til at sikre den højeste kvalitet, uvildig analyse. 16 protokoller kan blive fuldstændig automatiseret og delte for reproducerbarhed, og algoritmerne der bruges af leverandørejet software er let tilgængelig via biblioteker skal bruges af forskere, der har kendskab til moderne farmaceutiske eller open source udviklingsværktøjer. 17
Følgende protokol forklarer de nødvendige skridt for at udføre en sådan analyse på et veldefineret model af organogenesis, dannelsen af den kardiale Halvmåne under hjertet udvikling. Denne protokol beskriver specifikt, hvordan du (1) høst og dissekere hjerte Halvmåne fase embryoner, (2) udfører hele mount immunofluorescens for reference (Nkx2-5) og eksperimenterende (Foxa2Cre:YFP18,19) markører, (3) forberede og billede af embryoner ved hjælp af Konfokal mikroskopi, og endelig (4) analysere og kvantificere de fremkomne billeder ved hjælp af avancerede tredimensionale tilgange. Mens den kardiale Halvmåne bruges som et eksempel her, med passende ændringer, kan denne protokol anvendes til analyse af flere slægter i gastrula til tidlige somite fase embryoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen ovenfor beskriver en strategi for at opnå kvantitative data fra hele mount immunofluorescens billeder i høj kvalitet efter implantation mus embryoner. Når udført korrekt, kan den 3D-volumetriske data genereres gennem disse trin bruges til sammenlignende og stilling analyse af flere domæner inden for embryoet. Overflade signalet maskering fremgangsmåden er særlig nyttig når undersøger roman cellepopulationer sammenlignet med veletablerede reference strukturer.
Vi mener, at …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NIH/NHLBI R56 HL128646 og Mindich børns sundhed og udvikling Institute (MCHDI) på ISMMS (at N.D.). E.B. understøttes af en NIH/NIDCR praktikantopholdet T32 HD075735. Mikroskopi og billede analyse blev udført på mikroskopi kernen på Icahn School of Medicine på Mount Sinai, som er delvist understøttet af Tisch Cancer Institute på Mount Sinai P30 CA196521 – kræft Center støtte Grant.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
