Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

Résumé

Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)_180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.

Résumé

Névrite auto-immune expérimentale (EAN) est un modèle expérimental fort apprécié des maladies démyélinisantes périphériques auto-immunes. Maladie de l’EAN est induite par l’immunisation de souris avec des peptides neurogènes pour diriger une attaque inflammatoire vers les composants du système nerveux périphérique (PNS). Les progrès récents ont permis à l’induction de l’EAN dans la lignée de souris C57BL/6 relativement résistante à l’aide de la protéine zéro (P0)_106-125 ou P0_180-199 peptides livrés en adjuvant combinée à l’injection de la toxine de la coqueluche. La capacité d’induire l’EAN dans la souche C57BL/6 permet l’utilisation des nombreux outils génétiques qui existent sur cette toile de fond la souris et permet ainsi l’étude sophistiquée de la pathogenèse de la maladie et à l’interrogatoire de l’action mécanique de thérapeutiques novatrices dans combinaison d’approches transgéniques. Dans cette étude, nous démontrons une approche simple pour provoquer avec succès l’EAN en utilisant le peptide de_180-199 P0 chez les souris C57BL/6. Aussi, nous exposons un protocole pour l’évaluation des déficits fonctionnels qui se produisent dans ce modèle, accompagné d’un tableau de caractéristiques neuropathologiques. Ainsi, ce modèle est un puissant modèle expérimental pour l’étude de la pathogenèse de neuropathies démyélinisantes périphériques humains et pour déterminer l’efficacité des thérapies potentielles qui visent à favoriser la réparation de la myéline et protéger contre les dommages de nerf dans auto-immunes névrite.

Introduction

Les neuropathies périphériques peuvent être origine génétique ou acquise, avec neuropathies acquises ayant soit métabolique, ischémique, précipitants inflammatoires ou toxiques. Ces maladies sont également utilement classées comme axonale ou demyelinative à l’origine. Le plus souvent acquis démyélinisantes les neuropathies périphériques sont la polyneuropathie démyélinisante inflammatoire aiguë (paid, aussi connu comme le syndrome de Guillain-Barré, GBS) et Polyneuropathie inflammatoire chronique démyélinisante (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; les deux s....

Protocole

toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’Institut Florey pour les neurosciences et le Comité d’éthique de la santé mentale (Centre de cerveau de Melbourne) Animal et suivre le Code de pratique australienne pour l’utilisation des animaux pour scientifique Application.

1. Induction EAN

Remarque : EAN peut être induite avec succès chez les souris C57BL/6 mâles âgés de 6 à 8 semaines. Le protocole d’induction dure 9 jours au total. Jour 0 désigne le jour de la première vaccination. Pour ce protocole, les injections ont été réalisées sous anesthésie (voir étape ci-dessous 1.1.2).

Résultats

Peptide de_180-199 P0 induite par EAN dans des chenaux de souris C57BL/6 pour une maladie monophasique avec score clinique début de post 6 jours premier gravité score de vaccination (dpi) et maximale est observée du dpi 25 suivi par certains score clinique amélioration de 40 dpi durée (Figure 1)^4,9. En termes de fonction de la démarche, les souris commencent à échouer à une tâche en cours d’.......

Discussion

Le présent rapport décrit une méthode simple pour provoquer l’EAN utilisant le peptide de_180-199 P0 chez les souris C57BL/6, qui permet la quantification des principaux déficits neuropathologiques et fonctionnelles chez la souris induits avec EAN. Distincte pour le protocole d’induction EAN décrit ici est l’utilisation de l’anesthésie, tout en effectuant les injections de vaccination. L’utilisation de l’anesthésie isoflurane améliore grandement la capacité de faire en sorte que le volume total de l’inoculum es.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6, mâle, 6-8 semaines	Australian Bioresources Cenre, WA, Australie
toxines de coqueluche	Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0,1 M de souris isotonique phosphate tamponné salinisé (MT-PBS)			Les laboratoires auront leur propre protocole.
Les laboratoires d’Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australie		auront leur propre protocole d’administration.
P0180&ndash ; 199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180&ndash ; 199, séquence S&ndash ; S&ndash ; K&ndash ; R&ndash ; G&ndash ; R&ndash ; Q&ndash ; T&ndash ; P&ndash ; V&ndash ; L&ndash ; O&ndash ; A&ndash ; M&ndash ; L&ndash ; D&ndash ; H&ndash ; S&ndash ; R&ndash ; S
Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur (souche H37RA)	Difco, MI, États-Unis	#231141
Adjuvant complet de Freund (FCA)	Difco, MI, États-Unis#	263910
16 % de paraformaldéhyde (PFA)	Services de microscopie électronique	#15710	Diluer à 4 % de PFA le jour du prélèvement des tissus.
25 % de glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australie	#11-30-8	Diluer à 2,5 % de glutaraldéhyde jour de fixation.
Azoture de sodium	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australie	SL189	Créer 10 % (p/v) de stock dans 0,1 MILLION MT-PBS. Utiliser à 0,03 % (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australie	SA030	Utilisation à 30 % (p/v).
Température de coupe optimale (OCT) moyenne	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Sérum d’âne normal	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Utilisation comme diluant d’anticorps à 10 % (v/v) ou autre concentration déterminée par son propre laboratoire.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, États-Unis	#90o2-31-1	Utilisation dans un diluant d’anticorps à 0,3 % (v/v) ou à une autre concentration déterminée par son propre laboratoire.
protéine précurseur anti-amyloïde de lapin (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700 Utilisé	à 1:400 ou titré dans son propre laboratoire.
protéine 1 associée à l’anti-contactine de lapin (Caspr)	Don du professeur Elior Peles, Institut Wiezmann des sciences, Israël		Utilisé à 1:500 ou titré dans son propre laboratoire.
Anticorps secondaires conjugués au fluor Alexa appropriés	Sondes moléculaires (Life Technologies), OR, États-Unis	Divers	Utilisation à 1:200 ou titrage dans son propre laboratoire. Le choix de l’espèce dans laquelle l’anticorps a été élevé et d’Alexa Fluor choisi est à la discrétion de chaque laboratoire.
Solution d’enrobage aqueux	Dako (Agilent), CA, USA		Chaque laboratoire aura sa propre préférence.
Name	Company	Numéro de catalogue<	strong>Comments
Equipment
0.5 mL seringue avec 301/2 g aiguilles	BD	#326105
aiguilles de 23 g	BD	#305143
		encreur rouge	Tout tampon encreur rouge ou colorant alimentaire rouge peut être utilisé pour marquer les pattes des animaux.
Appareil DigiGate (y compris tapis roulant)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Système d’imagerie DigiGate	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Chronomètre			N’importe quelle minuterie peut être utilisée.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscope de dissection	Zeiss		Tout microscope de dissection approprié peut être utilisé.
Lames chargées	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		N’importe quel cyrostat approprié peut être utilisé.
Équipement de perfusion et instruments			Les laboratoires auront leurs propres protoctols de perfusion.
laboratoires peuvent produire leurs propres	récipients
Un		crayon de	cire ou une tension superficielle peuvent également être utilisés pour créer un puits autour de la section du tissu.
Microscope confocal	Zeis LSM780		Tout microscope confocal avec des lignes laser appropriées peut être utilisé.
FIDJI/Image J	Instituts nationaux de santé		Disponible à partir de www.fiji.sc

Liste des#S3023 Tampon de dissection Les en plastique opaque.