visualizing Macrophage Extracellular जाल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी
Summary
Macrophage extracellular जाल एक नए वर्णित इकाई हैं । इस अनुच्छेद के फोकल माइक्रोस्कोपी तरीकों पर ध्यान केंद्रित है और कैसे वे विट्रो में और फेफड़े के नमूनों से vivo में कल्पना कर रहे हैं ।
Abstract
न्युट्रोफिल extracellular जाल (नेट) की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया एक प्राथमिक विधि फोकल माइक्रोस्कोपी है । हम macrophage extracellular जाल (मेट्स) कल्पना करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी तरीकों की स्थापना संशोधित किया है । इन extracellular जाल के साथ extracellular क्रोमेटिन की उपस्थिति से परिभाषित कर रहे हैं-इस तरह के granules के रूप में अन्य घटकों की अभिव्यक्ति, lgg histones, और peptidyl arginase deiminase (पैड). मेट्स की अभिव्यक्ति आम तौर पर एक उत्तेजना के लिए जोखिम के बाद मापा जाता है और संयुक्त राष्ट्र की तुलना में प्रेरित नमूनों । नमूने भी पृष्ठभूमि और isotype नियंत्रण के लिए शामिल किए गए हैं । कोशिकाओं अच्छी तरह से परिभाषित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी दोनों विट्रो में और फेफड़े के ऊतकों में vivo में मेट्स की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), पहले Brinkmann एट अल द्वारा वर्णित किया गया । 1 वे मुख्य रूप से संक्रमण के जवाब में उत्पादित कर रहे हैं (विशेष रूप से बैक्टीरिया के लिए) और मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका है1,2. वे भी वाहिकाशोथ और प्रणालीगत एक प्रकार वृक्ष (SLE) सहित गैर संक्रामक रोग, के जवाब में होने के लिए वर्णित किया गया है; तथा mitogen phorbol १२-myrisate १३-एसीटेट (पमा)२,३। यह हाल ही में मांयता प्राप्त किया गया है कि अंय प्रकार के सेल भी extracellular जाल, मैक्रोफेज सहित उत्पादन कर सकते हैं । Macrophage extracellular जाल (मेट्स) अभी तक साहित्य4,5में एक अच्छी तरह से परिभाषित इकाई नहीं हैं । हम हाल ही में स्थापित तरीकों मेट्स दोनों विट्रो में और vivo में6,7की उपस्थिति का पता लगाने के लिए । इस लेख में, फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मेट्स का माप बताया जाएगा ।
NETosis की मुख्य विशेषताएं जो इसे अन्य सेलुलर रास्ते से अलग (जैसे apoptosis8) के साथ संयोजन के रूप में क्रोमेटिन के बाहर निकालना हैं: (1) citrullination of histones (H3Cit)9, (2) सह-अभिव्यक्ति का granules का टीज़र10 , और (3) peptidyl arginine deiminase (पैड) की भागीदारी 411,12। मैक्रोफेज भी H3Cit, granules, और पैड एक्सप्रेस, और इन सुविधाओं मेट्स की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
मेट्स फेफड़ों में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है, के रूप में macrophage alveoli और फेफड़े के एयरवेज में प्रमुख कोशिका मौजूद है और संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निर्देशन में प्रारंभिक भूमिका है/ इसके अलावा, जबकि फेफड़ों के ज्यादा खाली जगह है (जैसे, alveoli के भीतर), मेट्स संभावित रूप से उपलब्ध अंतरिक्ष में विस्तार कर रहे हैं, ठोस अंगों के विपरीत ।
सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि जाल की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप से है । मेट्स को मापने का अभी तक कोई स्पष्ट रूप से परिभाषित तरीका नहीं है । जाल की माप के लिए तकनीक इस प्रोटोकॉल में मेट्स की उपस्थिति को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है । इस विधि के लिए मुख्य आवश्यकताओं के विश्लेषण के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी और उचित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग कर रहे हैं ।
Protocol
इस प्रोटोकॉल में स्वीकृत प्रयोगों का अनुसरण करता है: (१) मोनाश चिकित्सा केन्द्र की आचार समिति द्वारा मनुष्य, और (२) पशु-मेलबोर्न विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा.
1. Bronchoalveolar लेवेज (bal) मैक्रोफ…
Representative Results
Discussion
विधि इस समीक्षा में वर्णित है कि14जाल की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल पर आधारित है । मैक्रोफेज बाल नमूनों में अब तक प्रमुख कोशिका प्रकार से कर रहे हैं और संग्रह की इस विधि मेट्स अध्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम मोनाश विश्वविद्यालय, राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, और मोनाश फेफड़े और सो संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखक मोनाश स्वास्थ्य, लगा हुआ Callaghan, एलेक्स Fulcher, Kirstin Elgass, और Camden माइक्रो इमेजिंग (मोनाश) के इम्यूनोलॉजी पर क्लिनिकल के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ मदद के लिए, और लेखक MMI सुविधाएं स्वीकार मोनाश विश्वविद्यालय के. लेखकों की सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, और मोनाश प्रोटोकॉल मंच के वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता ।
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
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