Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi
Summary
Makrofag extracellulära fällor är en nyligen beskriven enhet. Denna artikel koncentrerar sig på konfokalmikroskopi metoder och hur de är visualiseras in vitro- och in-vivo från lungan prover.
Abstract
En primär metod som används för att definiera förekomsten av neutrofila extracellulära fällor (nät) är konfokalmikroskopi. Vi har ändrat etablerade konfokalmikroskopi metoder för att visualisera makrofag extracellulära fällor (METs). Dessa extracellulära fällor definieras av förekomsten av extracellulära kromatin med samtidig uttryck för andra komponenter såsom granule proteaser, citrullinerade histoner och peptidyl arginas deiminase (PAD). Uttrycket av METs allmänhet mäts efter exponering för en stimulans och jämfört med un-stimulerad prover. Prover ingår också för bakgrunden och isotypen kontroll. Celler analyseras med väldefinierade bild analys programvara. Konfokalmikroskopi kan användas för att fastställa förekomsten av METs både in vitro- och in-vivo i lungvävnaden.
Introduction
Neutrofila extracellulära fällor (nät), beskrevs först av Brinkmann o.a. 1 de framställs huvudsakligen i svar på infektion (särskilt till bakterier) och har en viktig roll i värd försvar1,2. De har också beskrivits i Svaren till icke-smittsamma sjukdomar, inklusive vaskulit och systemisk lupus erythematosus (SLE); och till mitogen phorbol 12-myrisate 13-acetat (PMA)2,3. Det har nyligen erkänts att andra celltyper kan också producera extracellulära fällor, inklusive makrofager. Makrofag extracellulära fällor (METs) är ännu inte en väldefinierad enhet i litteratur4,5. Vi har nyligen etablerade metoder för att upptäcka förekomsten av METs både in vitro- och in-vivo6,7. I den här artikeln beskrivs mätning av METs använder konfokalmikroskopi.
Nyckel dragen av NETosis som skiljer den från andra cellulära vägar (till exempel apoptos8) är extrudering av kromatin i samband med: (1) citrullinering av histoner (H3Cit)9, (2) samtidig uttryck för granule proteaser10 , och (3) deltagande av peptidyl arginin deiminase (PAD) 411,12. Makrofager uttrycker också H3Cit, granule proteaser och PAD, och dessa funktioner kan användas för att fastställa förekomsten av METs.
METs kan ha en särskilt viktig roll i lungan, som makrofag är den dominerande cellen finns i alveolerna och luftvägarna i lungan och har de ursprungliga rollen i att styra cellulära immunsvaret mot infektion/inflammation. Medan mycket av lungan är tomt utrymme (t.ex., i alveolerna), är dessutom METs potentiellt kunna expandera till utrymmet som finns, i motsats till solid organ.
Den mest använda metoden för att definiera förekomsten av nät är av konfokalmikroskopi. Det finns ännu inte ett klart definierat sätt att mäta METs. Tekniken för mätning av nät har anpassats för att mäta förekomsten av METs i detta protokoll. De viktigaste kraven för denna metod är tillgång till konfokalmikroskopi och lämpligt bildprogram för analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs i denna översyn är baserad på som används för att fastställa förekomsten av nät14. Makrofager är överlägset den dominerande Celltypen i BAL prover och denna metoden för insamling är särskilt lämpad för att studera METs. Om det finns röda blodkroppar i BAL bör dessa celler vara lyserat med hjälp av ammoniumklorid. Förfarandet för BAL allmänhet aktiverar makrofager och därför förväntas att METs finns i FN-stimulerad prover. BAL makrofager är vanligtv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades genom bidrag från Monash University, National Health och medicinska forskningsrådet, och Monash Lung och Sleep Institute. Författarna vill tacka Personalen på klinisk immunologi vid Monash hälsa, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass och Camden Lo av Monash Micro Imaging (MMI) för hjälp med den konfokalmikroskopi imaging, och författarna erkänner MMI faciliteter Monash University. Författarna erkänner de faciliteter och vetenskapligt och tekniskt stöd av Monash histologi plattformen.
Materials
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
