Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung
Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.
Abstract
Viele außergewöhnliche Fortschritte wurden in der Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics, mit bestimmten technischen Fortschritte in der Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und isobare Kennzeichnung multiplexing Kapazität. Hier stellen wir eine tief-Proteomics Profilerstellungs-Protokoll, die 10-Plex Tandem Masse Tag (TMT) Kennzeichnung mit einem umfangreichen LC/LC-MS/MS-Plattform und Korrektur der Post-MS numerische Störungen genau ganze Proteome quantitate kombiniert. Dieses Protokoll enthält die folgenden Hauptschritten: Proteingewinnung und Verdauung, TMT Kennzeichnung, 2-dimensionale (2D) LC, hochauflösende Massenspektrometrie und computergestützte Datenverarbeitung. Qualitätskontrolle-Schritte sind für die Fehlersuche und Auswertung experimenteller Variation enthalten. Mehr als 10.000 Proteine in Säugetieren Proben können getrost mit diesem Protokoll quantitated. Dieses Protokoll kann auch auf die Quantifizierung der post-translationalen Modifikationen mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Diese gebündelte, robuste Methode ist ein leistungsstarkes Tool für die Proteomik-Analyse in einer Vielzahl von komplexen Proben, einschließlich Zellkultur, tierischen Geweben und menschlichen klinischen Proben.
Introduction
Next Generation Sequencing technologische Fortschritte führten zu einer neuen Landschaft für die Untersuchung biologischer Systeme und Krankheit beim Menschen. Dies hat eine große Anzahl von Messungen des Genoms, Transkriptom, Proteom, Metabolom und andere molekulare Systeme greifbar werden erlaubt. Massenspektrometrie (MS) ist eine der empfindlichsten Methoden in der analytischen Chemie und ihre Anwendung in der Proteomik expandierte schnell nach der Sequenzierung des menschlichen Genoms. In der Proteomik haben die letzten Jahren erhebliche technische Fortschritte in der MS-basierten quantitativen Analysen, einschließlich Isobaren Kennzeichnung und multiplexing Fähigkeiten kombiniert mit umfangreichen Flüssigchromatographie, neben Instrumentierung ergab. Vorschüsse, ermöglicht schnellere und genauere Messungen mit weniger Probenmaterial erforderlich. Quantitative Proteomik geworden ein mainstream-Ansatz für die Profilerstellung Zehntausende von Proteinen und posttranslationale Modifikationen im sehr komplexen biologischen Proben1,2,3,4 , 5 , 6.
Gemultiplexten isobare Kennzeichnung Methoden wie isobare Tag für relative und absolute Quantifizierung (d.h. iTRAQ) und Tandem-Massen-Tag (TMT) MS haben stark verbesserte Probendurchsatz und stieg die Zahl der Proben, die in einem einzigen analysiert werden können 1,6,7,8zu experimentieren. Zusammen mit anderen MS-basierte Quantifizierung Methoden wie markierungsfreie Quantifizierung und stabilen Isotop Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (d.h.SILAC), das Potenzial dieser Techniken in der Proteomik ist Feld beträchtliche9 ,10,11. Die TMT-Methode erlaubt zum Beispiel 10 Proteinproben zusammen mit 10-Plex-Reagenzien 1 Experiment analysiert werden. Diese baugleichen TMT-Tags haben die gleiche allgemeine Masse, aber schweren Isotope sind differentiell verteilt auf Kohlenstoff oder Stickstoff-Atome, wodurch eine einzigartige Reporter Ion während MS/MS Zersplitterung der einzelnen Tags, damit die relative Quantifizierung zwischen den 10 Proben. Die TMT-Strategie wird routinemäßig angewendet, um Studium biologischer Signalwege, Krankheitsverlauf und zelluläre Prozesse12,13,14.
Wesentliche technische Verbesserungen haben Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Systeme, sowohl in Bezug auf LC Trennungen und MS Parameter Proteinidentifikation zu maximieren, ohne Einbußen bei der Quantifizierung Genauigkeit verbessert. Erste Dimension Trennung von Peptiden durch eine Trennung Technik mit hoher Orthogonalität, die zweite Dimension ist entscheidend bei dieser Art der Schrotflinte Proteomics-Methode, um maximale Ergebnisse20zu erreichen. Hohem pH-Wert umgekehrt Phase flüssige Chromatographie (RPLC) bietet eine bessere Leistung als herkömmliche starke Kationenaustausch-Chromatographie20tut. Bei hohem pH-Wert RPLC-mit einer zweiten Dimension der Low-pH-RPLC-kombiniert wird, sind analytische Dynamikbereich und Protein Abdeckung verbessert wiederum die Möglichkeit, den Großteil der exprimierten Proteine zu identifizieren, wenn ganze Proteom Analysen15 durchführen, ,16,17,18. Andere technische Fortschritte sind kleine Partikel in C18 (1,9 µm) und lange Spalte (~ 1 m)19erweitert. Darüber hinaus sind andere bemerkenswerten Verbesserungen neue Versionen von Massenspektrometern mit schnellen Abtastraten, verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung20und anspruchsvolle Bioinformatik Pipelines für MS Data Mining21.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die neuesten Methoden mit Änderungen zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Durchsatz, während der Fokussierung auf Qualität Kontrollmechanismen in das Experiment beinhaltet. Das Protokoll enthält Proteingewinnung und Verdauung, TMT 10-Plex Kennzeichnung, grundlegende pH-Wert sauren pH-Wert RPLC-Fraktionierung, hochauflösende MS-Detektion und MS Datenverarbeitung (Abbildung 1). Darüber hinaus realisieren wir mehrere Qualitätskontrolle Schritte zur Fehlerbehebung und Auswertung experimenteller Variation. Dieses ausführliche Protokoll soll helfen Forschern neu auf dem Gebiet routinemäßig zu identifizieren und genau quantitate Tausende von Proteinen aus einem lysate oder Gewebe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen mit einer 10-Plex isobare Kennzeichnung Strategie, die erfolgreich in mehreren Publikationen12,13,14,32 umgesetzt worden . In diesem Protokoll können wir bis zu 10 verschiedene biologische Proteinproben in 1 Experiment analysieren. Wir können routinemäßig identifizieren und quantitate weit über 10.000 Prote…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken allen anderen Lab und Anlage Mitgliedern für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, und gewährt ALSAC. Die MS-Analyse wurde in der St. Jude Children Hospital Proteomics Forschungseinrichtung, teilweise unterstützt von NIH Cancer Center Support Grant P30CA021765 durchgeführt. Die Autoren danken Nisha Badders um Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
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