깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링
Summary
우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.
Abstract
많은 뛰어난 발전 질량 분석 (MS)에서 만들어진-proteomics, 액체 크로마토그래피 (LC)에 특정 기술 진보와 함께 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)을 isobaric 라벨 멀티플렉싱 용량 결합을 기반으로. 여기, 우리는 광범위 한 LC/LC-MS/MS 플랫폼, 그리고 정확 하 게 전체 proteomes을 quantitate 후 MS 전산 간섭 보정 10-플렉스 연동 대량 태그 (TMT) 라벨을 결합 하는 깊은 단백질 프로 파일링 프로토콜을 소개 합니다. 다음과 같은 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜: 단백질 추출 및 소화, TMT 라벨, 2 차원 (2D) LC, 고해상도 질량 분석 및 전산 데이터 처리. 품질 관리 단계는 문제 해결 및 실험적인 변화를 평가 합니다. 포유류 샘플에서 10000 개 이상의 단백질이 프로토콜 자신 있게 quantitated 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 사소한 변화를 가진 포스트 번역 상 수정 정량에도 적용할 수 있습니다. 다중화, 강력한 방법이 다양 한 세포 배양, 동물의 조직, 그리고 인간의 임상 들을 포함 하 여 복잡 한 샘플에서에서 proteomic 분석을 위한 강력한 도구를 제공 합니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 기술의 발전은 생물 학적 시스템을 연구 하 고 인간의 질병에 대 한 새로운 풍경에 이르렀다. 이 게놈, transcriptome, 프로테옴, 대사체, 및 유형 될 다른 분자 시스템의 측정의 많은 허용 하고있다. 질량 분석 (MS) 분석 화학에서 가장 중요 한 방법 중 하나 이며 proteomics에의 응용 인간 게놈 시퀀싱 후 급속 하 게 확장 했다. 프로 테오 믹스 분야에서 지난 몇 년 동안 MS 기반 정량 분석, isobaric 라벨 및 멀티플렉싱 계측 뿐만 아니라 광범위 한 액체 크로마토그래피와 결합 하는 기능을 포함 하 여 주요 기술 발전을 굴복 했다 진보, 더 빨리, 더 정확한 측정을 위해 필요한 적은 샘플 자료 허용. 양이 많은 proteomics 단백질과 posttranslational 수정 매우 복잡 한 생물 학적 샘플1,2,,34 에 수천 수만의 프로 파일링을 위한 주류 접근 되고있다 , 5 , 6.
멀티플렉스 isobaric 라벨 isobaric 태그 등 상대 및 절대 정량 (즉, iTRAQ) 및 탠덤 질량 태그 (TMT) MS는 크게 샘플 처리량 향상 방법과 단일에서 분석할 수 있는 샘플 수를 증가 실험1,6,,78. 다른 MS 기반 정량 방법과 함께 레이블 없는 정량 등 안정 동위 원소는 proteomics에 이러한 기술의 잠재력 세포 배양 (즉, 단기), 아미노산 라벨 필드는 상당한9 10,11. 예를 들어 방송 통신 방법 10 단백질 샘플 10 플렉스 시 약을 사용 하 여 1 실험에 함께 분석을 허용 한다. 이러한 구조적으로 동일 TMT 태그 같은 전체 질량, 하지만 무거운 동위 원소는 차동 상대 정량 함으로써 각 태그의 MS/MS 조각화 동안 독특한 기자 이온 인 탄소 또는 질소 원자에 배포 10 샘플 사이. 방송 통신 전략 생물 학적 경로, 질병의 진행 및 세포질 과정12,,1314에 정기적으로 적용 됩니다.
실질적인 기술 향상 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 시스템, LC 분판와 정량 정확도 희생 하지 않고도 단백질 식별을 최대화 하기 위해 MS 매개 변수 향상 했습니다. 에 2 차원 높은 직교로 분리 기술에 의해 펩 티 드의 첫 번째 차원 분리는이 유형의20최대 결과 달성 하기 위해 샷건 proteomics 방법에 중요 합니다. 높은 pH 반전 단계 액체 착 색 인쇄기 (RPLC)에 기존의 강한 이온-교환 크로마토그래피20보다 더 나은 성능을 제공 합니다. 분석 동적 범위와 단백질 범위 개선 높은 pH RPLC 낮은 pH RPLC의 두 번째 차원, 결합 될 때, 전체 프로테옴 분석15 를 수행할 때 표현한 단백질의 대량을 식별 하는 기능 결과 16,,1718. 기타 기술 진보 작은 C18 입자 (1.9 µ m)를 포함 하 고 긴 열 (~ 1 m)19를 확장. 또한, 다른 주목할 만한 개선 빠른 스캔 속도, 향상 된 감도 및 해상도20, MS 데이터 마이닝21에 대 한 정교한 생물 정보학 파이프라인 질량 분석기의 새 버전을 포함합니다.
여기, 우리는 실험을 통해 품질 관리 메커니즘에 집중 하면서 감도 처리량을 개선 하기 위해 수정 최신 방법론을 통합 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 포함 단백질 추출 및 소화, TMT 10-플렉스 라벨, 기본적인 pH 및 산 성 pH RPLC 분류, 고해상도 MS 검출 및 MS 데이터 처리 (그림 1). 또한, 우리는 문제 해결 하 고 실험적인 변화를 평가 하기 위한 여러 가지 품질 관리 단계를 구현 합니다. 이 상세한 프로토콜 연구원은 새로운 분야를 정기적으로 확인 하 고 정확 하 게는 lysate에서 단백질의 수천을 quantitate 도움을 것입니다 또는 조직.
Protocol
Representative Results
Discussion
여러 출판물12,,1314,32에서에서 성공적으로 구현 되었습니다는 10-플렉스 isobaric 라벨 전략으로 단백질의 정량에 대 한 높은 처리 프로토콜 설명 . 이 프로토콜에서 우리 1 실험에서 최대 10 다른 생물학 단백질 견본을 분석할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 식별 하 고 높은 자신감을가지고 잘 10000 단백…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 모든 다른 연구소 및 시설 회원을 도움이 토론에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 부분적으로 지원 되었다 NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, 및 ALSAC 부여. MS 분석 세인트 주드 어린이 연구 병원 Proteomics 시설, 보건원 암 센터 지원 그랜트 P30CA021765에 의해 부분적으로 지원 되는에서 수행 되었다. 저자에 대 한 원고를 편집 도움말 Nisha Badders 감사 합니다.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
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