Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software
Summary
Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.
Abstract
Foram feitos muitos avanços excepcionais em espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics, com progresso técnico particular em cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e capacidade de multiplexação rotulagem isobárica. Aqui, apresentamos um protocolo de perfil profundo-proteômica que combina 10-plex marca massa em tandem (TMT) rotulagem com uma extensa plataforma de LC/LC-MS/MS e interferência computacional pós-MS correção para dosar com precisão proteomes toda. Este protocolo inclui as seguintes etapas principais: extração de proteínas e digestão, TMT rotulagem 2-dimensional (2D) LC, espectrometria de massa de alta resolução e processamento de dados computacional. Etapas de controle de qualidade estão incluídas para solução de problemas e avaliando a variação experimental. Mais de 10.000 proteínas em amostras de mamíferos podem ser quantificadas com confiança com este protocolo. Este protocolo também pode ser aplicado para a quantificação de modificações borne-translational com pequenas alterações. Este método multiplexado, robusto fornece uma ferramenta poderosa para análise proteômica em uma variedade de amostras complexas, incluindo a cultura de células, tecidos animais e espécimes clínicos humanos.
Introduction
Avanços na tecnologia de sequenciamento de última geração têm levado a uma nova paisagem para o estudo de sistemas biológicos e doenças humanas. Isto tem permitido um grande número de medições do genoma, transcriptoma, proteoma, metabolome e outros sistemas moleculares para se tornar tangível. Espectrometria de massa (MS) é um dos métodos mais sensíveis em química analítica, e sua aplicação em proteômica expandiu-se rapidamente após o sequenciamento do genoma humano. No campo da proteômica, nos últimos anos produziram grandes avanços técnicos em análises quantitativas baseadas em MS, incluindo a rotulagem isobárica e multiplexação capacidade combinada com extensa cromatografia líquida, além de instrumentação avança, permitindo para medições mais precisas, mais rápidas, com menos material de amostra necessário. Proteómica quantitativa tornaram-se uma abordagem convencional para perfil de dezenas de milhares de proteínas e modificações posttranslational em amostras biológicas altamente complexo1,2,3,4 , 5 , 6.
Métodos de rotulagem isobárico multiplexados como tag isobárica para quantificação relativa e absoluta (ou seja, iTRAQ) e marca de massa em tandem (TMT) MS grandemente melhoraram a taxa de transferência de amostra e aumentou o número de amostras que podem ser analisados em um único experiência de7,1,6,8. Juntamente com outros métodos de quantificação com base em MS, como rótulo livre quantificação e isótopo estável, etiquetando com aminoácidos em cultura de células (ou seja, SILAC), o potencial destas técnicas na proteômica campo é considerável9 ,10,11. Por exemplo, o método TMT permite 10 amostras da proteína a ser analisados em conjunto em 1 experimento usando reagentes 10-plex. Essas tags TMT estruturalmente idênticos têm a mesma massa total, mas isótopos pesados são diferencialmente distribuídos nos átomos de carbono ou nitrogênio, resultando em um íon único repórter durante a fragmentação de MS/MS de cada marca, permitindo a quantificação relativa entre as 10 amostras. A estratégia TMT é rotineiramente aplicada para estudar processos celulares12,13,14, vias biológicas e progressão da doença.
Substanciais melhorias técnicas reforçar sistemas de cromatografia líquida (LC) – MS/MS, tanto em termos de separações de LC e parâmetros de MS, para maximizar a identificação da proteína sem sacrificar a precisão de quantificação. Primeira dimensão separação de peptídeos por uma técnica de separação com alta ortogonalidade para a segunda dimensão é fundamental neste tipo de método de proteomics espingarda para alcançar resultados máximos20. Cromatografia líquida de alta-pH fase reversa (SBST) fornece um melhor desempenho do que o de cromatografia de permuta catiónica forte convencional20. Quando alta-pH SBST é combinado com uma segunda dimensão da baixo-pH SBST, tanto a gama dinâmica analítica e a cobertura de proteína são melhoradas, resultando na capacidade de identificar a maior parte das proteínas expressas ao executar todo-proteome análises15 ,16,17,18. Outros avanços técnicos incluem pequenas partículas C18 (1,9 µm) e prolongado tempo de coluna (~ 1m)19. Além disso, outras melhorias notáveis incluem novas versões de espectrómetros de massa, com taxas de varredura rápida, melhorou a sensibilidade e resolução20e encanamentos de Bioinformática sofisticados para MS dados mineração21.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que incorpora as mais recentes metodologias com modificações para melhorar a sensibilidade e taxa de transferência, enquanto se concentra nos mecanismos de controle de qualidade durante todo o experimento. O protocolo inclui extração de proteínas e digestão, TMT 10-plex rotulagem pH básico e fracionamento de pH ácido SBST, deteção de MS de alta resolução e processamento de dados do MS (Figura 1). Além disso, implementamos várias medidas de controle de qualidade para solução de problemas e avaliando a variação experimental. Este protocolo detalhado destina-se a ajudar pesquisadores novo ao campo rotineiramente identificar e dosar com precisão milhares de proteínas de um lisado ou tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descreveremos um protocolo de alta produtividade para a quantificação de proteínas com uma 10-plex isobárica rotulagem estratégia que tem sido implementado com sucesso em várias publicações12,13,14,32 . Neste protocolo, podemos analisar até 10 amostras de diferentes proteínas biológicas no 1 experimento. Nós rotineiramente pode identificar e dosar bem sobre 10.000 proteínas com alt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças a todos os outros membros de laboratório e instalações para discussão útil. Este trabalho foi parcialmente financiado pela NI H concede R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 e ALSAC. A análise de MS foi realizada em Hospital Proteomics instalação St Jude Children, parcialmente financiado por subsídio NIH Cancer Center Support P30CA021765. Os autores agradecer Nisha Badders ajuda com edição do manuscrito.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
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