Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software
Summary
Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.
Abstract
Sono stati compiuti molti progressi eccezionali in spettrometria di massa (MS)-base di proteomica, con il progresso tecnico particolare in cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e capacità di multiplexing etichettatura isobarica. Qui, presentiamo un protocollo di analisi profonda-proteomica che combina i tag massa tandem 10-plex (TMT) etichettatura con un’ampia piattaforma di LC/LC-MS/MS e correzione post-MS computazionale interferenze per quantificare con precisione i proteomi tutto. Questo protocollo comprende le seguenti fasi: estrazione di proteine e digestione, TMT etichettatura, 2-dimensionale (2D) LC, spettrometria di massa ad alta risoluzione e computazionale di elaborazione dei dati. Procedura di controllo qualità è inclusa per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Più di 10.000 proteine in campioni di mammiferi possono essere quantificati con fiducia con questo protocollo. Questo protocollo può essere applicato anche per la quantificazione delle modifiche post traduzionale con modifiche minori. Questo metodo multiplex, robusto fornisce un potente strumento per analisi di proteomica in una varietà di campioni complessi, tra cui la coltura delle cellule, tessuti animali e umani campioni clinici.
Introduction
Gli avanzamenti nella tecnologia di sequenziamento di nuova generazione hanno portato ad un nuovo paesaggio per lo studio di sistemi biologici e malattia umana. Questo ha permesso un gran numero di misurazioni del genoma, trascrittoma, proteoma, metaboloma e altri sistemi molecolari a diventare tangibili. Spettrometria di massa (MS) è uno dei metodi più sensibili in chimica analitica, e la sua applicazione in proteomica ha rapidamente ampliato dopo il sequenziamento del genoma umano. Nel campo della proteomica, da alcuni anni hanno prodotto importanti progressi tecnici nella basata su MS-analisi quantitative, tra cui isobarica etichettatura e multiplexing capacità combinata con cromatografia liquida estesa, oltre alla strumentazione avanza, consentendo più veloce, più accurate misurazioni con meno materiale di campione richiesto. Proteomica quantitativa è diventati un approccio tradizionale per la profilatura di decine di migliaia di proteine e modifiche di posttranslational in campioni biologici altamente complessi1,2,3,4 , 5 , 6.
Metodi d’etichettatura isobariche multiplex ad esempio tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta (cioè, iTRAQ) e tag di massa tandem (TMT) MS hanno notevolmente migliorato la produttività del campione e aumentato il numero di campioni che possono essere analizzati in un unico esperimento1,6,7,8. Insieme con altri metodi di quantificazione basati su MS, come quantificazione privo di etichetta ed etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (cioè, SILAC), il potenziale di queste tecniche nella proteomica dell’isotopo stabile campo è notevole9 ,10,11. Ad esempio, il metodo TMT permette 10 campioni di proteine da analizzare insieme in 1 esperimento utilizzando reagenti 10-plex. Questi tag TMT strutturalmente identici hanno la stessa massa complessiva, ma isotopi pesanti differenzialmente sono distribuiti su atomi di carbonio o azoto, risultante in un ione unico reporter durante frammentazione MS/MS di ogni tag, consentendo pertanto una quantificazione relativa tra i 10 campioni. La strategia TMT è ordinariamente applicata per studiare vie biologiche, progressione di malattia e di processi cellulari12,13,14.
Notevoli miglioramenti tecnici sono migliorati sistemi di cromatografia liquida (LC)-MS/MS, sia in termini di LC separazioni e parametri di MS, per massimizzare l’identificazione della proteina senza sacrificare la precisione di quantificazione. Prima dimensione separazione dei peptidi mediante una tecnica di separazione con alta ortogonalità per la seconda dimensione è fondamentale in questo tipo di metodo di proteomica di fucile da caccia per ottenere i massimi risultati20. Cromatografia liquida a fase inversa ad alta pH (RPLC) offre prestazioni migliori rispetto a convenzionali scambio cationico forte cromatografia20. Quando alto pH RPLC è combinata con una seconda dimensione di basso pH RPLC, sia analitico gamma dinamica e la copertura della proteina sono migliorate, conseguente la capacità di identificare la maggior parte delle proteine espresse durante l’esecuzione di analisi intero proteoma15 ,16,17,18. Altri progressi tecnici includono piccole particelle C18 (1,9 µm) ed esteso lungo colonna (~ 1 m)19. Inoltre, altri miglioramenti importanti sono nuove versioni di spettrometri di massa con velocità di scansione rapida, una migliore sensibilità e risoluzione20e bioinformatica sofisticata pipeline per MS dati mining21.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che incorpora le più recenti metodologie con modifiche per migliorare la sensibilità e la velocità effettiva, mentre ci si concentra sui meccanismi di controllo di qualità in tutto l’esperimento. Il protocollo comprende estrazione di proteine e digestione, TMT 10-plex etichettatura, pH di base e frazionamento RPLC pH acido, ad alta risoluzione MS rilevamento ed elaborazione di dati di MS (Figura 1). Inoltre, realizziamo diversi passaggi di controllo di qualità per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Questo protocollo dettagliato è destinato ad aiutare i ricercatori nuovi al campo ordinariamente identificare e quantificare con precisione migliaia di proteine da un lisato o tessuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un protocollo ad alta velocità per la quantificazione delle proteine con una strategia di etichettatura isobarica 10-plex, che è stata implementata con successo in diverse pubblicazioni12,13,14,32 . In questo protocollo, possiamo analizzare fino a 10 campioni biologici differenti della proteina nell’1 esperimento. Ordinariamente possiamo identificare e quantificare ben oltre 10.00…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano tutti gli altri membri lab e impianto per utile discussione. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NI H concede ALSAC, R01AG047928, R01AG053987 e R01GM114260. L’analisi di MS è stata eseguita in Research Hospital proteomica Facility di St. Jude Children, parzialmente sostenuto da NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Gli autori ringraziano Nisha Badders per aiuto con il manoscritto di editing.
Materials
| 1220 LC system | Agilent | G4288B | |
| 50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
| Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
| Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
| C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
| DMSO | Sigma | 41648 | |
| Formic acid | Sigma | 94318 | |
| Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
| Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
| Lys-C | Wako | 125-05061 | |
| Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
| nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
| ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
| Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
| TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
| Trypsin | Promega | V511C | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
| Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |
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