O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio
Summary
Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.
Abstract
Vamos demonstrar um método usando Caenorhabditis elegans como um anfitrião modelo para estudar a interação microbiana. Micróbios são introduzidos através da dieta, tornando o intestino o local principal para a doença. O nematoide intestino estrutural e funcionalmente imita os intestinos de mamíferos e é transparente, tornando-se passível de estudo microscópico da colonização. Aqui nós mostramos que patógenos podem causar doenças e morte. Somos capazes de identificar microbianos mutantes que mostram a virulência alterada. Sua resposta inata conservada a estresses bióticos faz c. elegans , um excelente sistema para sondar as facetas de interações imune inata do hospedeiro. Mostramos que hosts com mutações no gene oxidase dual não podem produzir espécies reactivas de oxigénio e são incapazes de resistir insulto microbiano. Vamos demonstrar ainda mais a versatilidade do ensaio apresentado sobrevivência, mostrando que ele pode ser usado para estudar os efeitos de inibidores do crescimento microbiano. Este ensaio também pode ser usado para descobrir os fatores de virulência de fungos como alvos para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, bem como fornecer uma oportunidade para descobrir novas interações do anfitrião-micróbio. O design deste teste se presta bem para alta taxa de transferência do inteiro-genoma telas, enquanto a capacidade de vermes de crio-preservação para uso futuro torna um modelo todo animal rentável e atraente para estudar.
Introduction
C. elegans tem sido usado como um organismo modelo poderoso para mais de 50 anos. Na década de 1960, o biólogo Sul-Africano Sydney Brenner foi pioneira no uso de c. elegans , para estudar o desenvolvimento neuronal, pavimentando o caminho para uma longa linhagem de cientistas para estudar os vários aspectos da biologia celular e animal em nematoides. Esta linhagem inclui Prêmio Nobel laureates Craig Mello e Andrew Fire para o seu trabalho de RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston por seu trabalho no desenvolvimento de órgãos e apoptose2,3,4e Martin Chalfie por seu trabalho na proteína fluorescente verde5. Embora este organismo modelo tem sido tradicionalmente usado para estudar a biologia molecular e do desenvolvimento, nos últimos 15 anos, os pesquisadores começaram a usar c. elegans para investigar a biologia de vários patógenos humanos incluindo Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureuse Salmonella typhi6,7,8,9,10. Estes estudos revelaram que muitos dos mecanismos envolvidos na interação humano-patógeno são conservados em nematódeos, mas também que existem alguns mecanismos de imunidade que são exclusivos para este organismo de modelo11,12. Na natureza, c. elegans encontra uma variedade de ameaças de patógenos ingeridos presentes no solo e isso proporcionou uma forte pressão seletiva para evoluir e manter um sofisticado sistema imune inato no seu lúmen intestinal. Muitos dos genes e mecanismos envolvidos na proteção do lúmen intestinal são orquestrados por elementos altamente conservada que também existem em maior mamíferos11,13. C. elegans , portanto, representa um grande modelo para estudar a patógenos gastrointestinais como a Salmonella typhi14, Shigella boydii15ou Vibrio cholera16.
Aqui destacamos a versatilidade notável de c. elegans como um host de modelo para o estudo de agentes infecciosos, tais como c. albicans. C. elegans como um anfitrião modelo permite o rastreio de alto rendimento de virulência que é menos caro e demorado do que um modelo do rato, que é comumente usado para estudar a candidíase42.
Neste estudo, mostramos que este modelo e o ensaio de sobrevivência de assosiated podem ser confiável usados para estudar inata efetores hospedeiro imune importantes para combater infecções, determinantes do patógeno que impulsionam a virulência, e compostos farmacológicos que podem intervir na patogênese. Diferentes tipos de ensaios descritos anteriormente, este método fornece um meio de exposição a um agente patogénico a estudar sobre a vida do animal, desde a fase larval para a idade adulta, ao invés de apenas idade adulta a morte de43,44. Em resumo, nosso c. elegans – modelo de c. albicans é uma ferramenta versátil e poderosa que pode ser usada não somente para estudar as bases genéticas que levam a infecção e imunidade, mas também para identificar novos compostos para a intervenção terapêutica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos para análise do c. elegans infecção e sobrevivência sobre exposição de vida a c. albicans que descrevemos podem ser modificados para testar outro patógeno. Culturas líquidas de outra bactéria ou fungo podem ser feitas e alimentadas a c. elegans de forma semelhante. Além disso, infecções seriais podem ser analisadas primeiro, expondo a larva de um patógeno conforme descrito, e depois transferir os animais para uma nova placa contendo um patógeno separado depois de ating…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi realizado no e apoiado pelo Instituto Politécnico de Worcester.
Materials
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
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