Madagaskar väsande kackerlacka som en alternativ icke däggdjur djurmodell att undersöka virulens, patogenes och drogen effekt
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att utnyttja Madagaskar väsande kackerlacka som en alternativ icke däggdjur djurmodell att genomföra bakteriell virulens, patogenes, drug toxicitet, drogen effekt och medfödda immunsvar studier.
Abstract
Många aspekter av den medfödda immuniteten bevaras mellan däggdjur och insekter. En insekt, Madagaskar väsande kackerlacka från släktet Gromphadorhina, kan användas som en alternativ djurmodell för att studera virulens, värd-patogen interaktion, medfödda immunsvar och läkemedlet effekt. Detaljer för uppfödning, skötsel och avel av den väsande kackerlackan tillhandahålls. Vi illustrerar också hur det kan vara smittad med bakterier såsom de intracellulära patogenerna Burkholderia mallei, B. pseudomallei, och B. thailandensis. Användning av den väsande kackerlackan är billig och övervinner regleringsfrågor som behandlar användningen av däggdjur i forskning. Dessutom är resultat hittades med väsande kackerlacka modell reproducerbara och liknande som erhålls med hjälp av däggdjur modeller. Således representerar den Madagaskar väsande kackerlackan en attraktiv surrogat värd som bör undersökas vid djurstudier.
Introduction
Användning av insekter som alternativa icke däggdjur djurmodeller studera bakteriell patogenes och medfödda värd försvar har varit fart under de senaste åren. Logistiskt, beror detta på deras relativt billig kostnad och lättheten i att erhålla, hantering och skötsel av insekter jämfört med däggdjur. Det finns också ingen reglerande politik som styr användningen av insekter i forskning; Det är inte föremål faller eller begränsningarna av något djur använder kommittén eller statlig myndighet. Insekter som surrogat djurmodeller är särskilt mottagliga för omfattande screening studier för virulensfaktorer, värd-patogen interaktioner och bedömningar av antimikrobiella läkemedlet effekt. Deras användning kan minska antalet däggdjur används för forskning därigenom övervinna några av de etiska dilemman som inneboende beteende av djurförsök 1,2.
Insekter kan fungera som surrogat värdar eftersom det finns en hög grad av enhetlighet mellan de medfödda immunförsvar av insekter och däggdjur 1,3. Både insekt plasmatocytes och däggdjur makrofager phagocytose mikroorganismer 4. Insekt motstyckena till neutrofila är hemocyte 5,6. Intracellulära oxidative burst vägar i insekt och däggdjursceller är likartade. reaktiva syreradikaler i båda produceras av orthologous p47phox och p67phox proteiner 5. Signalering kaskader nedströms Toll receptorer i insekter och Toll-liknande receptorer och Interleukin-1 hos däggdjur är också anmärkningsvärt likartade. båda resulterar i produktion av antimikrobiella peptider, som defensins 7. Insekter kan således utnyttjas för att studera generella medfödd immun mekanismer som delas av metazoans.
En insekt som heter Madagaskar väsande kackerlacka från släktet Gromphadorhina, är en av de största kackerlacka arter som finns, når normalt 5-8 cm på förfallodagen. Det är infödda endast till den ön Madagaskar och kännetecknas av det väsande ljudet som det gör – ett ljud som produceras när den väsande kackerlackan förvisar luft genom luftvägarna öppningar kallas externa 8. Den distinkta väsa fungerar som en form av social kommunikation bland väsande kackerlackor för uppvaktning och aggression 9 och kan höras när en manlig är störd i sin livsmiljö. Madagaskar väsande kackerlacka är långsamma jämfört med den amerikanska kackerlackan och andra urbana skadedjur. Det är lätt att ta hand om och föda upp; en gravid väsande kackerlacka kan producera 20 till 30 avkomma i taget. En baby som väsande kackerlacka, kallas en nymf, når könsmognad i 5 månader efter genomgår 6 molts och kan leva upp till 5 år både i naturen och i fångenskap 8.
Vi har utnyttjat Madagaskar väsande kackerlacka som surrogat värd för infektion med intracellulära patogener Burkholderia mallei, B. pseudomalleioch B. thailandensis 10,11. Virulens hos dessa patogener i väsande kackerlackor jämfördes med deras virulens i den benchmark djurmodell för Burkholderia, syrisk hamster. Vi fann att den dödliga dosen för 50% (LD50) av B. pseudomallei och B. mallei var liknande i båda modeller 11. Intressant, är B. thailandensis, även om Avirulenta i gnagare modellen, dödliga i väsande kackerlacka 11. Denna skillnad med avseende på B. thailandensis infektion understryker nyttan av väsande kackerlacka modell; B. thailandensis förmildrande mutanter kan lättare lösas i den väsande kackerlackan än i djurmodeller. Dessutom som B. thailandensis används ofta som kunde modell organismen för B. pseudomallei och B. mallei 10,12,13, identifiera förmildrande mutationer i det leda till liknande mål i dess mer virulent släktingar.
Trots skillnaden i virulens B. thailandensis i den väsande kackerlackan kontra syrisk hamster, mutationer i kritiska virulensfaktorer, såsom de i typ 6 utsöndring system-1 (T6SS-1), som förmildrande i B. mallei och B. pseudomallei, är likaså förmildrande för B. thailandensis 11. Väsande kackerlacka modellen valideras ytterligare i det enskilda T6SS mutanter (T6SS-2 till T6SS-6) i B. pseudomallei, som har ingen bäring på virulens i syriska hamstrar, förbli virulent i väsande kackerlackor 11. Således är den väsande kackerlackan en livskraftig surrogat djurmodell för tre Burkholderia arter. Vi utnyttjas nyligen den väsande kackerlackan som ett surrogat djurmodell att undersöka effekten av den mot malaria läkemedel klorokin (CLQ) mot Burkholderia infektion 10 och dess toxicitet.
Här, vi beskriver uppfödning och skötsel av Madagascar väsande kackerlacka och ge Detaljer om hur att infektera denna insekt med tre Burkholderia arter. Dessutom visar vi att den väsande kackerlackan är en livskraftig surrogat-modell för att studera virulens och drogen effekt hos Burkholderia infektioner och att det sannolikt också kan fungera som en surrogat värd för andra bakteriella patogener i liknande studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optimal försöksbetingelser börjar med en hälsosam väsande kackerlacka koloni, som kräver en minimal men konsekvent tid engagemang. Även om väsande kackerlackor kan gå under en relativt lång tid (~ veckor) utan mat och vatten, varje vecka eller varannan vecka bur underhåll måste tillhandahållas. Detta inkluderar kontroll av mat och vatten och se till att buren är torr. Att upprätthålla torr levnadsvillkor är särskilt viktigt under acklimatisering och inkubation vid högre temperaturer. finner vi att mer …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer och A.M. Friedlander utformad procedurerna som beskrivs i manuskriptet. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli och D. DeShazer utfört experimenten. J. Chua skrev manuskriptet.
Författarna vill tacka Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter och Steven A. Tobery för utmärkt teknisk assistans och David P. Fetterer och Steven J. Kern för statistisk analys.
Arbetet stöddes av den försvar hot minskning byrån förslag nr CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F och #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 till D.D.
Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarnas och är inte nödvändigtvis godkändes av den amerikanska armén.
Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik av Department of Defense, eller nämner av varunamn, kommersiella produkter eller organisationer antyda av den amerikanska regeringen.
Materials
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M., Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. . Cellular Microbiology. , 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary?. New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
