Courants synaptiques sont enregistrables circonscrits de visualisé boutons synaptiques à la jonction neuromusculaire Drosophila troisième stade larvaire des larves. Cette technique permet la surveillance de l’activité d’un seul bouton synaptique.
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Article de méthode
Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
Drosophila jonction neuromusculaire (NMJ) est un système excellent modèle pour étudier la transmission synaptique glutamatergique. Les auteurs décrivent la technique des enregistrements macropatch focale des courants synaptiques de boutons visualisées à la NMJ de larves de drosophile . Cette technique nécessite la fabrication sur mesure de l’enregistrement de micropipettes, ainsi qu’un microscope composé avec un fort grossissement, objectif à immersion d’eau sur de longues distances, optique (DIC) de contraste interférentiel différentiel et un fluorescent système de fixation. L’électrode d’enregistrement est positionné sur le dessus un bouton synaptique sélectionné visualisé avec DIC optique, épi-fluorescence ou les deux. L’avantage de cette technique est qu’il permet de contrôle de l’activité synaptique d’un nombre limité de sites de libération. L’électrode d’enregistrement a un diamètre de quelques microns, et les sites de sortie positionnés à l’extérieur de la jante électrode n’affectent pas sensiblement les courants enregistrés. Les courants synaptiques enregistrées ont cinétique rapide et peuvent être facilement résolus. Ces avantages sont particulièrement importants pour l’étude des lignées mutantes de voler avec l’augmentation d’activité synaptique spontanée ou asynchrone.
Introduction
Drosophile est un système excellent modèle pour étudier les mécanismes moléculaires contrôlant la transmission synaptique. Le système neuromusculaire chez la drosophile est glutamatergique, et par conséquent la jonction neuromusculaire de drosophile (NMJ) peut être utilisée pour étudier les caractéristiques conservées de libération glutamatergique. Depuis Jan et de Jan étude1, le troisième stade larvaire a été largement utilisé pour étudier la transmission synaptique évoquée et spontanée en surveillant des potentiels de jonction excitateurs (PEJ) ou courants (EJC). PEJ figurent couramment dans les cellules avec une mi....
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Protocole
1. fabrication d’électrodes de l’enregistrement
protocole de- tirer les électrodes de verre
- utiliser ce qui suit pour l’extracteur de la microélectrode (voir Table des matières) :
- ligne 1 : Heat Tirez 510 - Vitesse 30 fois 250 ; Ligne 2 : Chauffer 490 Pull - Vitesse 30 fois 250.
Remarque : Les unités de temps correspondant à 0,5 ms par unité ; les autres unités sont relatifs. La valeur de la chaleur doit être ajustée pour chaque filament après avoir effectué le test de rampe.
- ligne 1 : Heat Tirez 510 - Vitesse 30 fois 250 ; Ligne 2 : Chauffer 490 Pull - Vitesse 30 fois 250.
- Utiliser un microscope (grossissement de x 35) pour s’assurer que le diamètre intérieur de l’électrode ex....
- utiliser ce qui suit pour l’extracteur de la microélectrode (voir Table des matières) :
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Résultats
Focal macropatch enregistrements permettent l’activité synaptique suivie de certains boutons synaptiques (Figure 5). Lorsque l’électrode est placée sur le dessus un bouton synaptique (Figure 5 a, site 1), les mEJCs enregistrés (Figure 5, site 1) ont une amplitude excédant sensiblement le niveau de bruit et forte hausse des phases (à une distance de milliseconde subsidiaire). Lorsque l’électrode d’enr.......
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Discussion
Drosophila représente un organisme modèle avantageux pour étudier la transmission synaptique. Plusieurs configurations d’enregistrement ont été utilisées à la NMJ larvaire, y compris des enregistrements intracellulaires de potentiels synaptiques, enregistrements de courants synaptiques avec deux électrodes voltage clamp33,34et focal macropatch enregistrements de courants synaptiques décrites ici. Cette dernière technique permet la quantification précise .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Pris en charge par l’octroi de NIH R01 MH 099557
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Sutter P-97 | Instrument Sutter | P-97 | Extracteur de microélectrodes |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI MF200 | Microforge | |
| Réservoirs en verre | WPI | B150-86-10 | Capteurs en verre |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Kit Silicone Élastomère | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone pour la préparation des plaques |
| dissection Goupilles de dissection | Amazon | B00J5PMPJA | Goupilles pour le positionnement des larves |
| Pince à épiler | WPIINC | 500342 | Pince à épiler pour placer les goupilles, enlever les entrailles et les trachées. |
| Ciseaux | WPIINC | 501778 | Ciseaux pour couper la cuticule des larves et des nerfs. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Microscope droit |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Objectif microscope 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Objectif de microscope 10X |
| Narishige Micromanipulateur | Narishige | MHW-3 | Micromanipulateur hydraulique à eau à trois axes |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Amplificateur électrophysiologique |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Stimulateur électrique |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolateur |
| TMC table antivibratoire | TMC | 63-9090 | Table antivibratoire |
| TMC cage de Faraday | TMC | 81-333-90 | cage de Faraday |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Ordinateur Digidata |
| Ordinateur | Dell | Dell Dimension 5150 | avec système d’exploitation Win XP |
| Porte-électrode | WPI | MEH3SW | Porte-électrode |
| Filtre optique | Omega optical | XF 115-2 | Cube de filtre pour la détection de la protéine fluorescente verte (GFP) |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Logiciel pour l’enregistrement du signal |
| Quantan | Logiciel interne | - | Logiciel pour le traitement du signal |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Ligne anti-mouche de contrôle |
| cpx SH1 | Don généreux de J.T. Littleton-Complexin | anti-mouche knock-out avec exocytose spontanée accrue | |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Mouche avec étiquette fluorescente neuronale (GFP) |
Références
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181
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Réimpressions et autorisations
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