Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila
Summary
Las corrientes sinápticas pueden grabarse focal de visualizadas botones sinápticos en la Drosophila tercer instar larvas Unión neuromuscular. Esta técnica permite la monitorización de la actividad de una sola bouton sináptico.
Abstract
Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) es un sistema modelo excelente para estudiar la transmisión sináptica glutamatérgica. Describimos la técnica de las grabaciones de macropatch focal de corrientes sinápticas de botones visualizados en la NMJ de Drosophila larvas. Esta técnica requiere fabricación modificada para requisitos particulares de grabación micropipetas, así como un microscopio compuesto equipado con un gran aumento, objetivo de inmersión de agua de larga distancia, óptica de interferencia diferencial (DIC) de contraste y un fluorescente accesorio. El electrodo de registro se coloca en la parte superior de un seleccionado bouton sináptico visualizado con DIC óptica, epi-fluorescencia o ambos. La ventaja de esta técnica es que permite seguimiento de la actividad sináptica de un número limitado de sitios de liberación. El electrodo de la grabación tiene un diámetro de varias micras, y los sitios de liberación colocados fuera del borde del electrodo no afectar significativamente las corrientes registradas. Las corrientes sinápticas grabadas tienen cinética rápida y pueden ser fácilmente resuelto. Estas ventajas son especialmente importantes para los estudios de líneas de mosca mutantes con mayor actividad sináptica espontánea o asincrónica.
Introduction
Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar los mecanismos moleculares de control de la transmisión sináptica. El sistema neuromuscular de Drosophila es glutamatérgica, y por lo tanto, la Unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) puede utilizarse para estudiar las características conservadas de liberación glutamatérgica. Desde Jan y de Jan estudio1, las larvas de tercer estadio se ha utilizado ampliamente para estudiar la transmisión sináptica espontánea y evocada mediante el control de los potenciales excitatorios cruce (EJPs) o corrientes (EJCs). EJPs comúnmente se registran intracelular con un micro-electrodo de vidrio afilado, y reflejan la actividad de la NMJ entera, incluyendo todos los botones haciendo sinapsis en la fibra muscular determinada.
Por el contrario, puede registrar la actividad de un número limitado de los sitios de liberación focal colocando una punta de micropipeta cerca terminales neuronales o varicosidades sinápticas. Esta técnica fue empleada originalmente por Katz y Miledi2y grabaciones extracelulares focal han sido empleadas con éxito en varias preparaciones de NMJ, incluyendo rana3,4,5, ratón6 , 7 , 8, crustáceos9,10,11,12,13,14,15,16y Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Este enfoque fue desarrollado por Dudel, que había optimizado macropatch recodificación electrodos24,25. En la implementación de Dudel, esta técnica muy igualados con el método de la abrazadera del remiendo flojo26.
La NMJ de Drosophila larvas ha definido claramente los botones sinápticos, y líneas transgénicas con las etiquetas fluorescentes neuronales genéticamente codificados (véase Tabla de materiales) están disponibles. Estas ventajas nos permitieron grabar EJCs y mEJCs de un bouton sináptico seleccionado20,21,22. Aquí, describimos esta técnica en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila representa un organismo modelo ventajoso para el estudio de la transmisión sináptica. Varias configuraciones de grabación se han utilizado en el NMJ larvas, incluyendo grabaciones intracelulares de potenciales sinápticos, grabaciones de corrientes sinápticas y voltaje de dos electrodos abrazadera33,34, macropatch focal grabaciones de corrientes sinápticas que se describe aquí. La última técnica permite la cuantificación precisa de la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo de la beca del NIH R01 MH 099557
Materials
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
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