Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları
Summary
Sinaptik akımları, Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromüsküler kavşak görüntülenmeyecektir sinaptik boutons üzerinden focally kaydedilebilir. Bu teknik, tek bir sinaptik bouton etkinliğini izleme sağlar.
Abstract
Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic sinaptik iletimi çalışmaya bir mükemmel model sistemidir. Biz odak macropatch kayıtları görüntülenmeyecektir boutons Drosophila larva NMJ, sinaptik akımlardan tekniğini tanımlamak. Bu teknik MİKROPİPETLER yanı sıra bileşik yüksek büyütme, uzun mesafe su daldırma amacı, farklı girişim kontrast (DIC) optik ve bir floresan mikroskop kayıt özelleştirilmiş imalat gerektirir Eki. Kayıt elektrot DIC optik, epi-floresan veya her ikisi ile görüntülenir seçilen bir sinaptik bouton üst kısmında konumlandırılmış. Bu teknik avantajı bu sınırlı sayıda site açıklaması sinaptik etkinliğini izlemeye olanak sağlamasıdır. Kayıt elektrot birkaç mikron çapında ve elektrot RIM dışında konumlandırılmış yayın siteleri kayıtlı akımları önemli ölçüde etkilemez. Kaydedilen sinaptik akımlar hızlı Kinetik var ve kolayca çözülebilir. Bu avantajlar özellikle mutasyona uğramış sinek hatları ile gelişmiş kendiliğinden ya da zaman uyumsuz sinirsel aktivite çalışmaları için önemlidir.
Introduction
Drosophila sinaptik iletimi denetleme moleküler mekanizmaları incelemek için mükemmel model bir sistemdir. Drosophila nöromüsküler sistemde glutamatergic ve bu nedenle Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic yayın korunmuş özelliklerini incelemek için kullanılabilir. Jan Jan’ın çalışma ve1beri üçüncü INSTAR larva geniş eksitatör kavşak potansiyeller (EJPs) veya akımları (EJC’ler) izleyerek uyarılmış ve spontan sinaptik iletimi çalışma için kullanılmıştır. EJPs yaygın olarak intracellularly bir keskin cam mikro elektrot ile kaydedilir ve onlar sinapslarda belirli kas lif yapım tüm boutons de dahil olmak üzere tüm NMJ etkinliğini yansıtır.
Buna ek olarak, sınırlı sayıda sürüm site etkinliğini focally nöronal terminalleri veya sinaptik varicosities yakınındaki bir micropipette ipucu konumlandırma tarafından kaydedilir. Bu teknik aslında Katz ve Miledi2tarafından istihdam edildi ve başarıyla kurbağa3,4,5, fare6 dahil olmak üzere birkaç NMJ hazırlıklar istihdam Fokal hücre dışı kayıtları , 7 , 8, kabuklu9,10,11,12,13,14,15,16ve Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Bu yaklaşım daha fazla elektrotlar24,25recoding macropatch en iyi duruma getirilmiş Dudel tarafından geliştirilmiştir. Dudel’ın uygulamasında bu teknik yakından gevşek-yama-kelepçe yöntemi26eşleştirdi.
Drosophila larva NMJ sinaptik boutons açıkça tanımladığı ve genetik olarak kodlanmış nöronal floresan Etiketler ( Tablo malzemelerigörmek) transgenik çizgilerle kolayca kullanılabilir. Bu avantajları bize EJC’ler ve seçili sinaptik bouton20,21,22mEJCs kaydetmek etkin. Burada, bu teknik ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila sinaptik iletimi çalışmaya bir avantajlı model organizma temsil eder. Sinaptik potansiyelleri, kayıtları iki elektrot gerilimi kelepçe33,34ve Fokal macropatch ile sinaptik akıntılarının hücre içi kayıtları da dahil olmak üzere larva NMJ, birkaç kayıt yapılandırma kullanılmıştır Burada açıklanan sinaptik akıntılarının kayıtları. İkinci tekniği görüntülenmeyecektir boutons kesin miktar sinaptik iletimi sağla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH grant R01 MH 099557 tarafından desteklenen
Materials
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
- Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
- Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
- Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
- Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
- Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
- Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
- Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
- Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
- Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
- Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
- Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
- Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
- Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
- Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
- Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
- Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
- Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
- Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
- Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
- Marrero, H. G., Lemos, J. R. . Loose-Patch-Clamp method. , (2007).
- Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
- Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
- Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
- Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
- Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
- Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).
