माउस कंकाल की मांसपेशी से क्रोमेटिन Immunoprecipitation के लिए बेहतर प्रोटोकॉल
Summary
वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी से क्रोमेटिन की तैयारी के लिए एक उपंयास प्रोटोकॉल क्रोमेटिन immunoprecipitation द्वारा मांसपेशी तंतुओं में जीन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित प्रस्तुत किया है ।
Abstract
हम वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी, संरचनात्मक प्रोटीन की एक उच्च सामग्री के साथ एक शारीरिक रूप से प्रतिरोधी ऊतक से क्रोमेटिन की तैयारी के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रोटोकॉल का वर्णन । वयस्क चूहों से विच्छेदित अंगों की मांसपेशियों को शारीरिक रूप से यांत्रिक homogenisation द्वारा बाधित कर रहे हैं, या नख़रेबाज़ और douncing का एक संयोजन, एक hypotonic बफर में formaldehyde निर्धारण के पहले सेल lysate. फिक्स्ड नाभिक कोशिका मलबे को दूर करने के लिए यांत्रिक homogenisation या douncing और अनुक्रमिक निस्पंदन के आगे चक्र द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । शुद्ध नाभिक को तुरंत या बाद में अवस्था में जमने के बाद sonicated जा सकता है । क्रोमेटिन कुशलता से sonicated किया जा सकता है और क्रोमेटिन immunoprecipitation प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, के रूप में प्रतिलेखन कारकों के लिए प्राप्त प्रोफाइल द्वारा सचित्र, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, और आबंध citrullinated संशोधनों । इस प्रोटोकॉल द्वारा तैयार क्रोमेटिन का उपयोग कर पाया बंधन घटनाओं मुख्य रूप से अन्य फाइबर से क्रोमेटिन की उपस्थिति के बावजूद मांसपेशी फाइबर नाभिक में जगह ले जा रहे हैं-संबंधित उपग्रह और endothelial कोशिकाओं. इस प्रोटोकॉल इसलिए वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशी में जीन विनियमन अध्ययन के लिए अनुकूलित है ।
Introduction
क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) और उच्च प्रवाह अनुक्रमण (चिप-seq) के लिए युग्मित विभिन्न ऊतकों में प्रतिलेखन और epigenetic जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के लिए पसंद के तरीके बन गए हैं और कक्ष-प्रकार1। इस तकनीक आबंध क्रोमेटिन संशोधनों के जीनोम व्यापक रूपरेखा, citrullinated संस्करण अधिभोग, और प्रतिलेखन कारक2,3बंधन की अनुमति देता है ।
जबकि प्रसंस्कृत कोशिकाओं से चिप प्रदर्शन अच्छी तरह से स्थापित है, स्तनधारी ऊतकों से चिप अधिक चुनौतीपूर्ण रहता है । चिप के लिए क्रोमेटिन की तैयारी कई महत्वपूर्ण कदम है कि हर ऊतक और कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता शामिल है । क्रोमेटिन प्रसंस्कृत कोशिकाओं के सेलुलर lysates या उनके नाभिक की शुद्धि के बाद से तैयार किया जा सकता है. स्तनधारी ऊतकों, कुशल lysis, formaldehyde निर्धारण, और नाभिक के शुद्धिकरण के मामले में क्रोमेटिन की इष्टतम वसूली सुनिश्चित करने के क्रम में महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, कि नाभिक को ठीक करने से पहले या उनके शुद्धिकरण के बाद के चुनाव के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है । इन बाधाओं के बावजूद, चिप सफलतापूर्वक ऐसे जिगर, वृषण, या मस्तिष्क4,5,6के रूप में ऊतकों से किया गया है । कंकाल की मांसपेशी के मामले में, इस तरह के एक शारीरिक रूप से प्रतिरोधी ऊतक, जो संरचनात्मक प्रोटीन की एक उच्च सामग्री प्रदर्शित की विघटन, और इसके नाभिक के अलगाव विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । इस विशिष्टता को देखते हुए, अंय ऊतकों के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशियों के लिए संतोषजनक परिणाम नहीं देते ।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए माउस कंकाल मांसपेशी ऊतक है कि शारीरिक रूप से ऊतक, formaldehyde निर्धारण बाधित शामिल है, और फिर नाभिक और sonication के अलगाव से चिप ग्रेड क्रोमेटिन अलग । इस विधि की दक्षता इस ऊतक से चिप के लिए उपयुक्त क्रोमेटिन तैयार करने के लिए चिप-qPCR और चिप-seq विभिन्न प्रतिलेखन कारकों के लिए प्रदर्शन करके प्रदर्शन किया गया था, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, और आबंध citrullinated संशोधन7.
इस नई तकनीक बहुत तेजी से है एक पहले रिपोर्ट प्रोटोकॉल8 लंबे समय collagenase पाचन चरणों के दौरान जिसके दौरान, प्रतिलेखन कारकों और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के जीनोमिक स्थानीकरण में परिवर्तन जगह ले सकते हैं । तेजी के साथ जो नाभिक अलग और तय कर रहे है विधि यहां विशेष रूप से क्रोमेटिन तैयार है कि अधिक ईमानदारी से देशी जीनोमिक अधिभोग राज्य कब्जा आकर्षक बताया जाता है । इसके अलावा, हालांकि क्रोमेटिन अलगाव या मांसपेशी ऊतक से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अंय तरीकों8,9,10 वर्णित किया गया है और चिप के लिए इस्तेमाल किया चयनित जीन पर qPCR प्रयोगों, कोई चिप-seq डेटा का उपयोग कर उंहें सूचित किया गया है । विधि यहां की रिपोर्ट प्रतिलेखन कारक और citrullinated संशोधन चिप seq के लिए उपयुक्त है, और इसलिए भी 3/4c या HiC क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त होना चाहिए ।
Protocol
चूहों को प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के संबंध में संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार रखा गया और राष्ट्रीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार (यूरोपियन कमीशन के डायरेक्टर 86/CEE/ फ्रेंच फरमान नं?…
Representative Results
Discussion
यहां हम वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों और शो से क्रोमेटिन तैयारी के लिए एक उपंयास प्रोटोकॉल का वर्णन है कि इस क्रोमेटिन चिप प्रयोगों कि प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी और आबंध मांसपेशी फाइबर नाभिक में citrullinat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम IGBMC उच्च प्रवाह अनुक्रमण सुविधा, “फ्रांस Génomique” कंसोर्टियम (ANR10-INBS-09-08) और विशेष रूप से IGBMC पशु सुविधा के कर्मचारियों में सभी IGBMC सामांय सेवाओं के एक सदस्य के सभी कर्मचारियों को धंयवाद । इस कार्य को CNRS, द INSERM, द AFM, द Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer, फ्रेंच स्टेट फंड के माध्यम से ANR के माध्यम से अनुदान का समर्थन किया गया Investissements d’Avenir बला ANR-10-IDEX-0002-02, द Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 और ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । एस जे Ligue राष्ट्रीयकृत contre le कैंसर और ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, और वी. यू द्वारा Ministère de l’Enseignement एट डे ला सूक्ष्म द्वारा समर्थित किया गया था । ID एक ‘ équipe labellisée ‘ का Ligue राष्ट्रीयकृत contre le Cancer है ।
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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