クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル
Summary
クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。
Abstract
成体マウス骨格筋構造蛋白質の含有量が高い物理的に抵抗性組織からクロマチンの準備のための効率的かつ再現性のあるプロトコルについて述べる。大人のマウスから切り裂かれた四肢の筋肉物理的、機械的均質化またはミンチと細胞ライセートのホルムアルデヒド固定前に低張性バッファー内の douncing の組み合わせによって中断されます。固定の核は機械的均質化または douncing 細胞の残骸を削除する連続ろ過のさらなるサイクルによって精製しました。精製された核は、すぐに、後の段階で凍結後する超音波に処理できます。クロマチンが効率的に超音波処理および転写因子、RNA ポリメラーゼ II、および共有結合のヒストンの修正のプロファイルによって示されているように、クロマチン免疫沈降実験に適した取得します。このプロトコルにより作製したクロマチンを使用して検出されたバインディング イベントは、主に筋線維核クロマチン繊維関連の他の衛星と血管内皮細胞からの存在にもかかわらずで行われているものです。このプロトコルはそのため成体マウスの骨格筋における遺伝子発現制御の研究に適応です。
Introduction
クロマチン免疫沈降 (チップ) の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に結合し、転写を研究する選択の方法と様々 な組織における遺伝子発現のエピジェネティック制御高スループット シーケンス (チップ seq) となっています。細胞タイプ1。この技法は、ゲノムは共有結合性クロマチン修飾ヒストン バリアントの占有率、転写因子結合2,3プロファイリングできます。
培養細胞からチップを実行することが確立している哺乳類動物組織からチップのままより困難です。チップのクロマチンを準備、組織切片・細胞の種類ごとに最適化が必要ないくつかの重要な手順が含まれます。クロマチンは、培養細胞の細胞の溶解液や、原子核の次の浄化から用意できます。哺乳類ティッシュの場合効率的な換散、ホルムアルデヒド固定および核の精製は、クロマチンの最適な回復を確保するために重要です。また、その浄化の前後に核を修正するかどうかの選択は実験的に決定します。これらの障害にもかかわらず、肝臓、精巣、または脳4,5,6などの組織からチップに正常に行われています。骨格筋の場合このような物理的に抵抗力がある組織、構造タンパク質の含有量が高いと核の分離を表わすは特に困難です。この特異性を考えると、他の組織のために最適化されたプロトコルを与えない満足のいく結果骨格筋の。
ここで物理的に破壊組織、ホルムアルデヒド固定し核と超音波処理の分離を含むマウス骨格筋組織からチップ グレード クロマチンを分離するプロトコルについて述べる。様々 な転写因子や RNA ポリメラーゼ II、コバレントマテリアルのヒストンの修正7の qPCR チップとチップ seq を実行することによってこの組織からチップに適したクロマチンを準備するこの手法の有効性を示した.
この新しい技術が以前に報告されたプロトコル8時間、転写因子のゲノムのローカライゼーションの変更中に長いコラゲナーゼ消化手順を構成するよりもはるかに高速と遺伝子発現の変化が起こるかもしれない。速さを核隔離され、固定は、ここで説明する方法をより忠実にネイティブのゲノムの占有状態をキャプチャするクロマチンを準備する特に魅力的になります。また、筋肉組織からクロマチンの分離または蛋白質の抽出のための他の方法が記述されている8,9,10され選択した遺伝子、チップ seq チップ qPCR 実験用データは、それらを使用して報告されています。ここで報告メソッドは転写因子やヒストン変更チップ seq に適した、それゆえ必要があります 3/4 C や HiC クロマチン構造キャプチャ ・ アプリケーションに適しても。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでアダルト マウス骨格筋このクロマチンは筋線維核内転写因子結合と共有結合のヒストンの修正を検出チップ実験に適しているショーからクロマチンを準備するための新しいプロトコルについて述べる。このプロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。最初の dounce または機械的剪断によって実行することができます組織混乱です。機械的剪断はより速くより再現性の高い、?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は特に IGBMC 動物施設のスタッフのスタッフ IGBMC 高スループット シーケンス機能、「フランス Génomique」コンソーシアム (ANR10-INBS-09-08) のメンバー、IGBMC のすべての一般的なサービスをありがちましょう。この作品は、CNRS、INSERM、AFM、リーグ国立 contre le 癌からの補助金によって支えられた、フランスの国営ラベル ANR-10-アイデックス-0002-02、Labex INRT ANR-10-アイデックス-0001-02 Investissements d’Avenir プログラムの下で ANR を通じて基金とANR-AR2GR-16-CE11-009-01。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。S.J にミニステール デ期リーグ国立 contre le 癌と ANR-AR2GR-16-CE11-009-01、V.U によって支えられらデ ラ凝った。ID は ‘デフランス labellisée’ リーグのナシオナル contre le がんです。
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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