Улучшенная протокол для иммунопреципитации Chromatin от мыши скелетных мышц
Summary
Представлен Роман протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц, адаптированы для изучения регуляции генов в мышечных волокон иммунопреципитации chromatin.
Abstract
Мы Опишите эффективной и воспроизводимые протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц, физически устойчивостью тканей с высоким содержанием структурных белков. Расчлененных конечностей мышцы от взрослых мышей физически подорван механической гомогенизации или сочетание мясорубки и douncing, в гипотонический буфера до фиксации формальдегида lysate клетки. Фиксированная ядер очищаются путем дальнейшего циклов механической гомогенизации или douncing и последовательного фильтрации для удаления мусора ячейки. Очищенные ядра может быть sonicated немедленно или на более позднем этапе после замораживания. Могут эффективно sonicated хроматина и подходит для экспериментов иммунопреципитации chromatin, как иллюстрируется профили получается факторов транскрипции, РНК-полимераза II и ковалентный гистона модификаций. События привязки, с помощью хроматина, подготовленный этот протокол являются преимущественно те, кто принимает место в ядер мышечных волокон, несмотря на присутствие хроматина от других связанных волоконно спутника и эндотелиальных клеток. Этот протокол таким образом приспособлен для изучения гена регулирование в скелетных мышцах взрослых мыши.
Introduction
Иммунопреципитации Chromatin (обломока) в сочетании с количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и высокая производительность виртуализации (чип seq) стали методы выбора для изучения транскрипции и эпигенетическую регуляцию экспрессии генов в различных тканях и типов клеток1. Эта техника позволяет генома общесистемной профилирования ковалентных chromatin изменения, гистонов вариант размещение и транскрипционным фактором привязки2,3.
Хотя выполнение чип от культивируемых клеток является хорошо организованной, чип от тканей млекопитающих остается более сложным. Подготовка chromatin чипа включает в себя несколько важных шагов, которые должны быть оптимизированы для каждого типа ткани и клетки. Хроматин могут быть приготовлены из клеточных лизатов культивируемых клеток или следующие очистки их ядер. В случае тканей млекопитающих эффективной лизиса, формальдегид фиксации и очистки ядер важны для того, чтобы обеспечить оптимальное восстановление хроматина. Кроме того выбор ли исправить ядер до или после их очистки должен быть экспериментально определены. Несмотря на эти препятствия чип успешно выполнена из ткани, такие как печень, яичка или мозга4,5,6. В случае скелетных мышц нарушение такого физически устойчивостью ткани, которая обладает высоким содержанием структурных белков и изоляции его ядер является особенно сложным. Учитывая эту специфику, протоколы, оптимизированный для других тканей не дают удовлетворительных результатов для скелетных мышц.
Здесь мы описываем протокол изолировать хроматина чип класса от мыши скелетной мышечной ткани, которая включает в себя физически нарушить ткани, формальдегид фиксации, а затем изоляции ядер и sonication. Выполняя чип ПЦР и чип seq для различных факторов транскрипции, РНК-полимераза II и ковалентный гистона изменения7была продемонстрирована эффективность этого метода подготовить хроматина, подходящую для чип из этой ткани.
Этот новый метод гораздо быстрее, чем сообщалось ранее протокол8 , включающий давно коллагеназы пищеварение шаги во время которого, изменения в геномной локализация транскрипционных факторов и изменения в экспрессии генов может занять место. Быстрота, с которой ядер изолированных и фиксированной делает метод, описанный здесь особенно привлекательным для подготовки хроматина, что более точно отражает состояние родной геномной размещение. Кроме того хотя другие методы для извлечения изоляции или белка хроматина из мышечной ткани были описаны8,9,10 и используется для чип ПЦР экспериментов на отдельных генов, не чип seq данные поступили с их помощью. Метод, сообщили здесь подходит для транскрипционного фактора и гистона изменения чип seq и поэтому должны быть также пригодны для 3 / 4C или МКХ хроматина конформации захвата приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем Роман протокол для подготовки хроматина от взрослой мыши скелетных мышц и показать, что это хроматина подходит для чип экспериментов, которые обнаружить связывания фактор транскрипции и ковалентный гистона изменения в ядер мышечных волокон. Этот протокол включает ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех сотрудников объекта последовательности IGBMC высокой пропускной способности, членом консорциума «Франция Génomique» (ANR10-INBS-09-08) и все IGBMC общих услуг в частности сотрудников животных фонда IGBMC. Эта работа была поддержана грантов из CNRS, INSERM, AFM, le Национальная лига против рака, французский государственный фонд через НРУ по программе Investissements будущее помечены АНР-10-IDEX-0002-02, Labex нар INRT-10-IDEX-0001-02 и ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Le Национальная лига против рака и ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, и V.U S.J была поддержана Ministère де образования et de la исследований. Идентификатор является «équipe labellisée» le Национальная лига против рака.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
