Förbättrat protokoll för kromatin Immunoprecipitation från mus skelettmuskulatur
Summary
Ett nytt protokoll för beredning av kromatin från vuxen mus skelettmuskulatur anpassas till studiet av genreglering i muskelfibrer av kromatin immunoprecipitation presenteras.
Abstract
Vi beskriver ett effektiv och reproducerbara protokoll för beredning av kromatin från vuxen mus skelettmuskulatur, en fysiskt resistenta vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade lem muskler från vuxna möss störs fysiskt av mekaniska homogenisering eller en kombination av malning och douncing, i en hypoton buffert innan formaldehyd fixering av cellen lysate. Den fasta kärnan renas genom ytterligare cykler av mekaniska homogenisering eller douncing och sekventiell filtreringar ta bort cellfragment. Renat atomkärnor kan vara sonicated omedelbart eller i ett senare skede efter frysning. Kromatinet kan vara sonicated effektivt och är lämplig för kromatin immunoprecipitation experiment, som illustreras av profilerna erhålls för transkriptionsfaktorer, RNA-polymeras II och kovalenta Histon ändringar. De bindande händelser detekteras med hjälp av kromatin som utarbetats av detta protokoll är huvudsakligen de som äger rum i muskelfiber kärnor trots närvaron av kromatin från andra fiber-associerade satellit- och endotelceller. Detta protokoll är därför anpassade för att studera genreglering i vuxen mus skelettmuskulaturen.
Introduction
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kopplat till kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) och hög genomströmning sekvensering (ChIP-seq) har blivit metoderna för val att studera transkription och epigenetisk reglering av genuttryck i olika vävnader och celltyper1. Denna teknik tillåter genome-wide profilering av kovalent kromatin modifieringar, Histon variant beläggning och transkription faktorn bindande2,3.
Utför ChIP från odlade celler är väl etablerad, fortfarande ChIP från däggdjur vävnader är mer utmanande. Förbereda kromatin ChIP omfattar flera kritiska steg som behöver optimeras för varje vävnads- och typ. Kromatin kan framställas från den cellulära lysates odlade celler eller följande rening av deras kärnor. När det gäller däggdjur vävnader är effektiv lysis, formaldehyd fixering och rening av atomkärnor avgörande för att säkerställa optimal återhämtning av kromatinet. Dessutom har valet att fixa atomkärnor före eller efter deras rening skall bestämmas experimentellt. Trots dessa hinder, har ChIP framgångsrikt utförts från vävnader såsom levern, testiklar, eller hjärnan4,5,6. När det gäller skelettmuskler är störningar av sådan en fysiskt resistenta vävnad, som uppvisar en hög halt av strukturella proteiner och isolering av dess kärnor särskilt utmanande. Med tanke på denna specificitet, ger protokoll optimerad för andra vävnader inte tillfredsställande resultat för skelettmuskulaturen.
Här beskriver vi ett protokoll för att isolera ChIP-grade kromatin från mus skelettmuskulaturen vävnad som innebär fysiskt störa vävnaden, formaldehyd fixering och sedan isolering av kärnor och ultraljudsbehandling. Effektiviteten av denna metod för att förbereda kromatin passar ChIP från denna vävnad demonstrerades genom att utföra ChIP-qPCR och ChIP-seq för olika transkriptionsfaktorer, RNA-polymeras II och kovalenta Histon ändringar7.
Denna nya teknik är mycket snabbare än en tidigare rapporterade protokoll8 bestående av långa kollagenas matsmältningen steg under vilken tid, förändringar i genomisk lokalisering av transkriptionsfaktorer och förändringar i genuttryck kan äga rum. Snabbhet med vilken atomkärnor är isolerad och fast gör den metod som beskrivs här särskilt attraktivt att förbereda kromatin som mer troget fångar tillståndet infödda genomisk beläggning. Dessutom, även om andra metoder för kromatin isolering eller protein utvinning från muskelvävnad har har beskrivs8,9,10 och använts för ChIP-qPCR experiment på valda gener, utan ChIP-seq data har rapporterats med dem. Den metod som redovisas här är lämplig för transkription faktorn och Histon ändring ChIP-seq, och därför bör också vara lämplig för 3 / 4C eller HiC kromatin konformation capture program.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett roman protokoll för att förbereda kromatin från vuxen mus skelettmuskulaturen och visa att denna kromatin är lämplig för ChIP experiment som upptäcka transkription faktorn bindande och kovalenta Histon ändringar i muskelfiber kärnor. Detta protokoll omfattar flera viktiga steg. Först är vävnad störningar som kan utföras antingen genom dounce eller genom mekanisk klippning. Mekanisk klippning är snabbare och mer reproducerbar, och är därför metoden för val. Ändå, om ingen lämpli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar all personal IGBMC hög genomströmning sekvensering anläggningen, medlem av ”Frankrike Génomique” konsortiet (ANR10-INBS-09-08) och alla IGBMC allmänna tjänster särskilt Personalen på IGBMC djuranläggningen. Detta arbete stöds av bidrag från CNRS, INSERM, AFM, det Ligue Nationale contre le Cancer, fransmännen statliga fonden genom ANR under programmet Investissements pris märkt ANR-10-IDEX-0002-02, den Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 och den ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. S.J. stöddes av det Ligue Nationale contre le Cancer och ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 och V.U av Ministère de l’Enseignement et de la Recherche. ID är en ‘équipe labellisée’ för Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
