בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית
Summary
כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.
Abstract
המטרה של הליך זה היה כדי לקצור #4 בטן בלוטות מוגדלות של עכברים nulliparous הנשי כדי להעריך ביטוי ECM ואדריכלות ductal. . הנה, כיס קטן מתחת לעור נוצר באמצעות מספריים מאיו, ומאפשר פרידתה של הבלוטות בתוך רקמת השומן התת עורית הצפק המשמש כבסיס. ויזואליזציה של הבלוטות נעזרה השימוש 3.5 x-R זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי. הפרווה היה. הפוך, נצמיד המאפשר זיהוי של הידיות שומן החלב ללא פגע. אחד של בלוטות בטן #4 היה בוטה מבותרים על-ידי הזזה הלהב האזמל רוחבית בין השכבה התת עורית הבלוטות. מיד לאחר הקציר, בלוטות הונחו בפורמלין במאגר נייטרלי 10% עבור עיבוד רקמות עוקבות. כריתה של בלוטת כולו הוא יתרון, כי זה בעיקר מבטלת את הסיכון של אי-כלילת חשוב רקמות ברוחב אינטראקציה בין תאים אפיתל ductal אוכלוסיות אחרות microenvironmental הסלולר שלא יכול להיות בביופסיה חלקית. חסרון אחד של המתודולוגיה הוא השימוש סעיפים טורי רקמות קבוע אשר מגביל את ניתוח של הביטוי מורפוגנזה וחלבון ductal במיקומים נפרדים בתוך בלוטת. ככזה, שינויים בביטוי חלבונים ואדריכלות ductal 3 מימד (3D) אינה השגה בקלות. בסך הכל, הטכניקה ישימה ללימודים הדורשים עטין מאתר שלם כל החקירות במורד הזרם כגון התפתחותית ductal מורפוגנזה או השד סרטן.
Introduction
סרטן השד מאופיין על ידי מידה ניכרת של רקמות פיברוזיס1,2,3,4. מכונה ECM, הישות-סלולר זו הוא נמצא בדרגות ברקמות כל, מורכבת בעיקר meshwork מורכבים של collagens fibrillar ו- fibrillar, אלסטין glycoproteins בנוסף מולקולות איתות שונים כי הם רע מטריצה זו. בתנאים homeostatic, התצהיר והשפלות של ECM מפוקחת. 5 במהלך tumorigenesis השד, האיזון של התצהיר ECM והשפלה משובשת. ככזה, גידולים בשד דווחו לבטא שופע ECM חלבונים כגון collagens, fibronectin, tenascin-C בין השאר. 6 הביטוי לא תקין של חלבונים אלה בנוסף דפוסים מוגברת של מטריקס crosslinking תועד כדי לקדם את השד הגידול התקדמות, גרורות, טיפול ההתנגדות1,3, 4,–7,–8,–9.
כדי להעריך הרכב ECM ו מורפולוגיה ductal, בוצע בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע. כאן, אנחנו המשמש עכברים nulliparous נקבה לקויה caveolin-1, חלבון ממברנלי אינטגרלי אשר נקשר אגרסיבי השד הגידול החתימה10,11,12, שליטה נשית B6 nulliparous עכברים. צביעה של רקמות אלה ועיבוד היסטולוגית מותר זיהוי חלבונים שונים ECM עם אפיון ductal מורפולוגיה.
בסך הכל, בידודו של בלוטות מוגדלות שלם, שלם נותן חוקרים ההזדמנות לחקור את רקמת מורפולוגיים או הסלולר שינויים המתרחשים כתגובה גורמים אקסוגניים או אנדוגני. החסרונות של הטכניקה משויכות ניתוחים של 2 סעיפים רקמות מימד (2D) לעומת מבט תלת-ממד, אשר יניב תמונה שלמה יותר של המורפולוגיה מורכבים של העץ ductal. לאור המורכבות של אינטראקציות תא התא, התא-ECM המתרחשים בבלוטת החלב, בידודו של בלוטות שלם, תקין יש יתרון לניתוח ביעילות ductal מורפולוגיה וחלבונים ביטוי באזורים שונים מאתר החלב בלוטת.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעיתון תארנו טכניקה כדי לבודד את העכבר ללא פגע בלוטות מוגדלות עבור ניתוחים היסטולוגית במורד הזרם של מורפולוגיה ductal וביטוי ECM. לגבי ניתוחים של מורפולוגיה ductal, מתודולוגיה זו מאפשרת חקירת ארכיטקטורת ductal מבוסס את סעיפים מוכתמים היסטולוגית מהירה. שיטות אחרות של ניתוחים ductal להסתמך על זריקות של…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר אפריל וויילס, ד ר רוג’ר Broderson לקבלת סיוע עם necropsy בעלי חיים ובידוד בלוטת, בהתאמה. מימון עבור עבודה זו נתמכה על ידי המרכזים פילדלפיה המכללה לרפואה אוסטאופתי עבור כרונית בהפרעות של הזדקנות.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
